01 前言
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2022年3月，Takashi Ishio等人在Blood發表“Genome-wide CRISPR screen identifies CDK6 as a therapeutic target in adult T-cell leukemia/lymphoma”，該研究通過全基因組CRISPR敲除篩選發現多個成人T細胞白血病淋巴瘤（Adult T-cell leukemia/lymphoma, ATLL）特異依賴的關鍵基因，并針對CDK6深入探究，證明TP53失活的ATLL細胞由于CDK2激活而對CDK6抑制劑更加耐受，聯合mTOR抑制劑可以協同抑制不同TP53狀態的ATLL細胞。該發現為臨床ATLL治療提供了新的靶點和用藥策略。

02 背景介紹

ATLL是一類惡性的血液系統腫瘤，它與I型人類嗜T淋巴細胞病毒（HTLV-I）的感染有關。臨床中現有的化療效果往往不理想，長期生存率低于20%，因此急需找出調節ATLL細胞增殖生存的關鍵通路，以它們為靶標開發新的治療方法。功能基因組篩選可以尋找腫瘤所依賴的關鍵分子，包括維持腫瘤細胞增殖和生存的關鍵通路。這項研究利用全基因組CRISPR-Cas9文庫，對多個ATLL模型進行篩選，以期發現新的治療策略。

03 研究思路

1、通過全基因組CRISPR/Cas9失活篩選尋找ATLL細胞的依賴基因，排除其他細胞普遍依賴的關鍵基因，確定9個ATLL細胞特異性依賴的候選關鍵基因。（關鍵基因篩選）

2、對部分候選基因逐一驗證，分別對各候選基因進行敲除，檢測對ATLL細胞增殖的影響，然后針對不同候選基因的功能進行相應的實驗探究，證明候選基因有臨床轉化價值。（候選基因驗證）

3、以CDK6為切入點，利用臨床使用的CDK6抑制劑帕博西尼進行藥物處理，證明蛋白水平抑制CDK6能夠也能阻滯細胞周期、增加細胞凋亡從而抑制ATLL細胞生長。（抑制劑處理）

4、已知TP53影響CDK6抑制劑治療效果，并且能夠抑制CDK2。通過不同TP53狀態的ATLL細胞系，以及構建的TP53敲除細胞系，證明TP53失活的ATLL細胞系對帕博西尼更加耐受。通過進一步敲除CDK2，證明TP53增強帕博西尼對ATLL抑制效果依賴于其對CDK2的抑制。（耐藥機制探究）

5、CRISPR篩選結合通路分析發現ATLL依賴于mTORC1信號通路，經過細胞增殖以及下游分子磷酸化水平檢測的驗證后，分別對ATLL細胞系、患者分離的原代細胞以及小鼠異種移植模型進行CDK6和mTOR抑制劑藥物處理，在體外和體內水平證明聯合用藥對任何TP53狀態的ATLL治療效果更加顯著。（聯合用藥策略）

04 研究內容

作者對KK1、ST1和Su9T01這3個ATLL細胞系進行全基因組CRISPR失活篩選，在找的1278個關鍵基因中，排除大多數細胞都依賴的核心關鍵基因，以及兩個套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma, MCL）細胞系的關鍵基因，最終確定了9個ATLL細胞特異的候選關鍵基因。它們分別參與不同的調節通路，包括AP-1家族轉錄因子（BATF3和JUNB），細胞周期G1-S轉換調節因子（CDK6和CCND2），JAK/STAT通路成員（STAT3和IL10RB），RNA結合蛋白（SYNCRIP和ZFP36L2），和一個異戊烯轉移酶亞基（PTAR1）。

在初步驗證部分候選基因后，作者以細胞周期相關候選基因為切入點深入探究。CCND1、CCND2和CCND3是G1/S期的細胞周期蛋白，它們與CDK4或CDK6相互作用形成活性激酶，通過磷酸化并抑制Rb蛋白促進G1-S期轉換。免疫印跡顯示ATLL細胞敲除CDK6后，Rb磷酸化水平降低。CDK6敲除特異性抑制ATLL細胞，并且可以被CDK6異位表達回補，CDK4異位表達回補效果較弱。與預期一致，CDK6敲除使得ATLL細胞發生G1期阻滯，此外也能誘導細胞凋亡。敲除CCND2與敲除CDK6產生的表型基本一致。

考慮到CDK6對ATLL的抑制作用，作者進一步挖掘CDK6作為ATLL治療靶點的潛力。研究表明CDK4/6抑制劑帕博西尼能夠抑制多種不同細胞系，并且在ATLL細胞系中使得Rb磷酸化水平降低、發生G1期阻滯以及細胞凋亡。既往研究發現在許多不同腫瘤類型中TP53突變與CDK4/6抑制劑耐受相關，將ATLL細胞系按照TP53的狀態分組，發現TP53變異（突變或缺失）的ATLL細胞對帕博西尼更加耐受。APR-246是一種能夠使突變的TP53恢復轉錄激活性質的小分子，TP53突變的ATLL細胞經APR-246處理后對帕博西尼更加敏感，但TP53缺失的細胞沒有明細的影響。對ST1細胞進行TP53敲除后，在帕博西尼處理下其生長速度高于TP53野生型的ST1細胞。TP53敲除介導的帕博西尼耐受也體現在細胞增殖、周期和凋亡等表型。TP53能通過誘導p21表達阻止G1/S期轉換，p21結合并抑制CDK2/Cyclin E。在ST1細胞中，CDK6的失活或抑制會增加p21和CDK2抑制因子p27的表達，但TP53基因失活的ATLL細胞系中不會出現這一情況，表明帕博西尼對ATLL細胞產生理想的抑制效果可能需要抑制CDK2。確實，對TP53突變的KK1和TP53缺失的Su9T01細胞或敲除TP53的ST1細胞在進一步敲除CDK2后，帕博西尼處理下的生長速度下降。至此，作者揭示了TP53能通過抑制CDK2增強ATLL對帕博西尼的敏感性。

通過對CRISPR篩選結果進行通路分析，發現ATLL細胞依賴mTORC1信號通路。MTOR敲除能夠抑制多種ATLL細胞生長，免疫印跡顯示ST1細胞中mTOR下游通路分子處于磷酸化狀態。鑒于既往研究顯示CDK和mTOR抑制劑聯合用藥對不同類型腫瘤的有益效果，作者利用mTOR抑制劑與帕博西尼處理不同ATLL細胞系，結果顯示mTOR抑制劑與帕博西尼可以協同抑制不同TP53狀態的ATLL細胞，兩抑制劑聯合作用對Rb磷酸化水平的抑制效果也高于分別單獨用藥。

作者進一步對ATLL患者原代細胞進行探究，與細胞系實驗結果一致，帕博西尼能夠濃度依賴地抑制ATLL原代細胞增殖，在聯合mTOR抑制劑后抑制程度增加，而對其他正常的T細胞沒有明顯影響。為在體內水平探究聯合用藥的安全性和有效性，作者將ATLL細胞接種至小鼠體內建立異種移植模型并給藥，結果顯示mTOR抑制劑與帕博西尼分別單獨用藥時即可抑制移植瘤生長，聯合用藥后的抑制效果則更加顯著，同時藥物處理對小鼠體重沒有顯著影響，證明這一策略的安全性和有效性。

綜上所述，這篇文章利用CRISPR/Cas9文庫尋找ATLL關鍵基因，選擇臨床可靶向的激酶CDK6作為切入點，探討治療效果和耐藥機制，并提供新的聯合用藥策略，研究思路值得借鑒。

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