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標簽： 細胞 免疫熒光
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免疫熒光技術（Immunofluorescence technique ）又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發展最早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內抗原物質的定位。
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實驗材料 細胞樣品
試劑、試劑盒 多聚甲醛 ? ?70%甲醇 ? 丙酮 ? ?PBS ? ?Triton ? BSA ? DAPI染液 ? DABCO ? ?Tris ? 甘油
儀器、耗材 玻片
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實驗步驟
細胞爬片免疫熒光實驗步驟
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第一天：
1. 在培養板中將已爬好細胞的玻片用PBS浸洗3次，每次3min；
2. 用4%的多聚甲醛固定爬片15min， PBS浸洗玻片3次，每次3min；
3. 0.5%Triton X-100( PBS配制 )室溫通透20min（細胞膜上表達的抗原省略此步驟）；
4. PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30min；
5. 吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗并放入濕盒，4℃孵育過夜；
第二天：
6. 加熒光二抗： PBST 浸洗爬片3次，每次3min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中20-37℃孵育1h，PBST浸洗切片3次，每次3min；注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行。
7. 復染核：滴加DAPI避光孵育5min，對標本進行染核，PBST 5min×4次洗去多余的DAPI；8. 用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。?
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基本實驗步驟：
（1） 細胞準備。對單層生長細胞，在傳代培養時，將細胞接種到預先放置有處理過的蓋玻片的培養皿中，待細胞接近長成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。
（2） 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢后的細胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.
（3） 通透。使用交聯劑（如多聚甲醛）固定后的細胞，一般需要在加入抗體孵育前，對細胞進行通透處理，以保證抗體能夠到達抗原部位。選擇通透劑應充分考慮抗原蛋白的性質。通透的時間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.
（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.
（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.
（6） 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
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（一）細胞準備
用于免疫熒光實驗的細胞可以是直接生長在蓋玻片上的貼壁細胞，也可以是經過離心后涂片的懸浮細胞或者是將取自體內的組織細胞懸液離心后涂片。貼壁良好的細胞一般在培養時直接放入coverslips讓細胞生長在其上即可，盡量避免使用貼壁性能不好的細胞進行免疫熒光實驗，以免后續的漂洗操作引起細胞脫落。少數實驗需要使用這類細胞或者懸浮細胞進行免疫熒光觀察，建議使用細胞離心甩片機制備細胞片或直接制備細胞涂片。