導讀：自從抗體被發現以來，有多種方法可用于分離純化抗體，全球的科學家們一直在探索高效的單抗分離純化方法，以及適于抗體藥物規模生產的工藝。

制備高特異性、高效價的抗體是實驗免疫學技術及抗體藥物療效的基礎，未純化或純化不好的抗體，不僅會干擾實驗的正常進行，而且還可能產生與實驗預期相悖的結論，抗體試劑質量的高低將直接影響實驗數據準確性、穩定性甚至實驗的成敗。

為了獲得成分相對單一的抗體或將抗體用于特定的用途，就需要進行抗體純化，這樣一方面可以顯著降低非特異性本底，去除易引起實驗誤差的污染蛋白或雜質；另一方面，也能精確控制實驗中產生陽性信號的抗體量及提高檢測試劑的靈敏度及準確性。在多種不同的技術中,親和層析是純化抗體最具選擇性、快速和容易的純化方法。對于IgG的純化，通常情況下，我們都會選擇使用Protein A或Protein G進行親和層析。

提到Protein A和Protein G，相信大家并不陌生，由于它們和抗體的特異性親和作用，可用于純化抗體，免疫共沉淀實驗等，其應用非常廣泛。為了更好的區分與選擇Protein A和G，小編在此，將對這兩類填料的“來世今生”一一進行介紹。

Protein A層析：

天然的Protein A是一種金黃色葡萄球菌細胞壁蛋白質，分子量42kD，它能夠特異性地結合多種免疫球蛋白的Fc區，而與Fab區結合很弱，具有5個IgG結合結構域(A,B,C,D,E,見下圖)和未知功能的非Fc結合域（X,見下圖），此結構的蛋白A在大量結合IgG的同時，由于其非Fc結合域結合部分雜蛋白，導致洗脫下來的IgG純度不夠。天然的Protein A結構示意圖如下：

圖1：天然的Protein A結構示意圖

對此，科學家利用基因工程的方法對Protein A基因進行改造，將蛋白A的Fc結合結構域（即IgG結合結構域）進行保留，對其非Fc結合域截短，分子量變小為35kD，其非特異性結合明顯降低，也消除了對Fab段的親和作用。同時末端經過改造后加上一個C端的半胱氨酸，利用環氧活化的方式單點偶聯到瓊脂糖上，在降低空間位阻的同時也提高IgG的結合能力。

但是無論天然蛋白A還是重組蛋白A依然存在對NaOH高度敏感，在強堿性條件下易變性或脫落，因此運用時只能選用高濃度的鹽酸胍或尿素進行清洗，但清洗的效果遠遠不如NaOH，導致清洗成本非常高。后經研究發現，在重組蛋白A的5個結合結構域中，B位點的結合IgG能力最強，通過將B位點對堿敏感的Asp 氨基酸突變為耐堿的氨基酸，其耐堿性大大提高，然后對該區段進行復制，得到新的四聚體配基SuRe Ligand，其載量更高，避免了Protein A中不同IgG結合結構域與抗體Fc段親和性的差異，使得洗脫條件更加均一而溫和。相比以rProtein A 為配基的介質，Mabselect SuRe介質可以用更高的pH進行洗脫，可有效避免抗體在低pH下的聚集，純化的產品純度和均一性更高，濁度也更低。

圖2：天然蛋白A、重組蛋白A及SuRe的基因改造位點及相互關系圖

近年來，Cytiva又重磅推出的全新概念纖維基質親和層析產品HiTrap Fibro PrismA 和 HiScreen Fibro PrismA。此系列產品顛覆了傳統瓊脂糖骨架的純化模式，利用了纖維束高流速和高通量的特點，通過Fibro 全新基架+PrismA 配基強強聯合，極大縮短了蛋白的保留時間，使得一次抗體純化在5分鐘內輕松搞定。在具有高載量高通量的同時，此層析介質能夠耐受 2M NaOH，確保能夠實現更高效的清潔和滅菌?？蓪⒄麄€工藝生產周期縮短在一天之內完成。生產能力相較于傳統填料能提高 20 倍以上。

綜上所述，由于Protein A耐堿形式的突變體，具有高選擇性和穩定性，脫落更少。因此，在實驗室和工業生產工藝中，大家都會選擇protein A親和層析作為抗體純化的一個標準步驟。作為層析純化的第一步，從澄清的細胞培養上清液中捕獲抗體，通過此步，IgG樣品純度一次純化可超過90%，并且適用于所有人源的(非IgG3)抗體和Fc融合蛋白的純化。

Protein G層析：

Protein G是從G類鏈球菌（Streptococci）中分離出來的胞壁蛋白，分子量25kDa，相對于Protein A，Protein G對于大多數哺乳動物的IgG有著更高的親和力。

由于天然Protein G不僅與免疫球蛋白的恒定區相結合,且與白蛋白、α2-巨球蛋白相結合,這使得用天然Protein G親和色譜提純抗體時,無法去除體系中存在的白蛋白和巨球蛋白。目前這一問題已經通過基因修飾的方法表達Protein G得以解決，重組蛋白G已經去除了白蛋白結合位點（血清白蛋白是抗體來源的主要污染物）及細胞表面結合位點，減少了非特異性結合。

對于抗體的Fc段，Protein G與Protein A均可結合，不同的是Protein G還能結合Fab段，因此，Protein G可以結合更多類型的IgG分子及多克隆IgG分子，尤其是對人IgG3，小鼠IgG1和鼠 IgG2a。因此，Protein G可用于純化不能與Protein A很好結合的哺乳動物單抗和多抗IgG。但由于protein G的填料要比protein A的貴不少，且載量比較低，洗脫的時候protein G的pH要比protein A更低一些，因此，目前多數情況下只是作為Protein A備選填料使用。

圖3：Protein G與Protein A結合位點的簡單圖示

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