供稿人：舒易來團隊
2022年2月23日，復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院舒易來主任、李華偉教授與中國農業科學院（深圳）農業基因組研究所左二偉研究員等團隊合作在Cell Research期刊在線發表題為“Treatment of autosomal recessive hearing loss via in vivo CRISPR/Cas9-mediated optimized homology-directed repair in mice”的研究論文。該研究以腺相關病毒（Adeno-associated virus，AAV）作為高效的基因治療遞送載體，轉染聽覺內毛細胞，用一種優化的HMEJ（同源臂介導的末端接合）的基因敲入方法精準修復Klhl18lowf耳聾模型的點突變，實現在體Klhl18lowf基因有效編輯，恢復感受聲音的內毛細胞靜纖毛形態，并糾正耳聾小鼠模型的聽覺功能長達治療后6個月。這是首家基于CRISPR/Cas9-HMEJ技術治療隱性遺傳性感音神經性聾成功的研究，為遺傳性耳聾的精準治療以及臨床轉化提供了強有力的科學證據。
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據世界衛生組織（WHO）官網報道，超過全球人口的5%，即4.66億人患有致殘性聽力障礙，其中3400萬是兒童。盡管研究發現超過120個基因與非綜合征型或綜合征型耳聾相關（http://hereditary hearing loss.org/），但臨床上對于遺傳性感音神經性聾的治療除了佩戴助聽器和植入人工耳蝸等，尚無任何有效的藥物治療手段。在非綜合征型遺傳性耳聾中，常染色體隱性遺傳性耳聾占80% (Korver et al., 2017)。
對于隱性遺傳性耳聾，最佳的治療方法是對基因突變位點進行精準地修復，進而長久地恢復聽力。CRISPR/Cas9基因編輯系統是近年來興起的新型基因編輯工具，已在疾病的治療中表現出了巨大的應用潛力。該系統主要由sgRNA和Cas9兩部分組成，二者形成復合體， sgRNA與靶位點反向互補實現定位后，同時識別PAM序列，Cas9核酸酶切割DNA，導致DNA發生斷裂。細胞內主要有兩種DNA損傷修復機制，非同源末端連接（Non-homologous end-joining，NHEJ）和同源重組修復（Homologous recombination，HR）。當有外源性DNA模板存在時，利用HR可以實現序列的任意精確變換或者定點插入，但其效率不高，尤其在非分裂細胞中，HR的效率更低，這極大限制了HR在基因治療領域的應用。
研究團隊在先前的研究中通過在同源模板兩側引入sgRNA的靶位點，開發了一種以同源臂介導的末端接合（Homology-Mediated End Joining，HMEJ）為基礎的基因敲入策略 (Yao et al., 2017)，在體內、體外均實現了高效而精確的整合（圖1）。HMEJ介導的基因敲入方法為包括基因編輯動物模型的建立和遺傳性疾病的精準靶向基因治療等提供了廣闊的前景。目前，尚無基于CRISPR/Cas9介導的HR策略進行耳聾基因治療的體內研究。
圖1 設計HMEJ同源重組治療方案。a 針對篩選的sgRNA，設計HMEJ同源臂。b 基于AAV作為體內遞送載體的雙AAV治療體系，其中一個AAV遞送用于表達Cas9的載體，另外一個遞送表達sgRNA以及攜帶同源臂的載體。
Klhl18lowf小鼠模型
Klhl18lowf小鼠模型是指Klhl18 p.V55F發生錯義點突變（Chr9:110455454 C>A），其純合子小鼠表現為第4周開始出現以低頻為主的漸進性聽力下降，隨著年齡增長，聽力下降逐漸累及其它頻率，最后發展為全頻型嚴重耳聾，而雜合子小鼠聽力正常，表現為隱性遺傳。Klhl18lowf隱性遺傳性耳聾小鼠模型在形態學方面表現為耳蝸內毛細胞纖毛的形態異常 (Ingham et al., 2021)。
CRISPR/Cas9-HMEJ體系
該研究首先針對基因Klhl18lowf突變位點設計、篩選和構建了HMEJ治療體系。在新生小鼠皮膚成纖維細胞中進行體外sgRNA篩選，發現sgRNA2的效率較高。將表達Cas9的質粒與攜帶HMEJ同源模板和表達sgRNA2的質粒共同轉染至帶有Klhl18lowf突變的成纖維細胞中，發現突變位點明顯得到了的糾正，且sgRNA2不產生明顯的脫靶編輯。
基于CRISPR/Cas9-HMEJ體系體內驗證
體外實驗證實設計的HMEJ系統可以精確糾正Klhl18lowf點突變后，該研究進一步在體內探索該系統的療效。用雙AAV包裝CRISPR/Cas9-HMEJ基因修復體系，即AAV9-SaCas9-KKH和AAV-PHP.eB-sgRNA-donor，將其在Klhl18lowf新生鼠出生后1天（P1）顯微注射至小鼠的內耳。在小鼠P14和10周齡時，體內編輯效率檢測結果表明，雙AAV治療系統在體成功糾正了Klhl18基因C>A點突變，隨著編輯時間的延長，10周齡的修復效率提高了約3倍，而在未注射耳中，沒有觀察到明顯的堿基插入、缺失或突變堿基的糾正。通過掃描電鏡技術，與野生型小鼠相比，發現8周齡的未治療純合突變小鼠的內毛細胞最高一排靜纖毛表現為更長、更細且頂端成尖細的錐形，而治療后的小鼠有部分內毛細胞的靜纖毛恢復正常的形態，表現為最高一排靜纖毛大部分呈柱形且更短。在治療后小鼠耳蝸的頂圈和中圈，平均約16%的內毛細胞具有正?；蚪咏５睦w毛束形態。聽性腦干反應（auditory brainstem response, ABR）測試結果顯示注射AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治療體系后8周，注射耳的ABR閾值在8、16、24和32 kHz均比未注射耳明顯下降，且治療效果持續至小鼠24周齡（實驗觀察期）。電生理檢測結果顯示，在較長時間（200 ms）的去極化脈沖刺激條件下，未注射耳的內毛細胞膜電容與野生型相比明顯下降，而AAV-CRISPR/Cas9-HMEJ治療體系能將注射耳內毛細胞膜電容恢復至野生型水平，即治療體系修復了內毛細胞持續囊泡釋放功能。
綜上所述，基于CRISPR/Cas9-HMEJ策略可對體內內耳毛細胞中的基因突變位點進行精準的糾正，恢復了耳蝸部分內毛細胞靜纖毛形態、修復了內毛細胞持續囊泡釋放功能并持久改善了Klhl18lowf隱性遺傳性耳聾小鼠的聽覺功能，為最終在人類隱性遺傳性耳聾及其它器官系統隱性遺傳性疾病中實現安全、持久的基因治療提供了科學依據和參考。
復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院舒易來研究員、李華偉教授和中國農業科學院（深圳）農業基因組研究所左二偉研究員為共同通訊作者，顧晰博士后、胡新德博士后（中國科學院神經科學研究所）和王大奇博士后為共同第一作者。
和元生物有幸提供實驗中使用的AAV載體，用實際行動助力中國神經科學的發展。