作者：Nadia Tagnaouti1 , Anitha Thomas1 , Rebecca De Souza1 , Ian Backstorm1 , Andrew Brown1 , Eric Ouellet1 , Shyam Garg1 , Grace Tharmarajah1 , Keara Marshall1 , Shannon Chang1 , Timothy Leaver1 , Andre Wild1 , Oscar Seira2,3, Jie Liu2,3, Wolfram Tetzlaff2,3, Peter Deng4,5 , David J. Segal5 , Jan A. Nolta4 , Kyle D. Fink4 , R. James Taylor1 and Euan Ramsay1

1 Precision NanoSystems Inc., Vancouver, BC, Canada, 2 International Collaboration on Repair Discoveries (ICORD), 3 Department of Zoology, 4 Stem Cell Program and Institute for Regenerative Cures, University of California Davis Health Systems, Sacramento, CA, USA, 5 Genome Center, MIND Institute, and Biochemistry and Molecular Medicine, University of California, Davis, CA, USA

近年來，對一種能夠在體內和體外傳遞有效載荷以調節基因表達的高效傳遞工具的需求一直在穩步增長。脂質納米粒(LNPs)利用協同載脂蛋白E (apoE)的單劑量傳遞途徑，通過低密度脂蛋白受體(LDLR)介導包裹核酸的有效傳遞。然而，它們從實驗臺到臨床的應用都受到了相當大的限制，因為在制造過程中遇到了大大小小的挑戰。在這里，我們通過描述脂質納米顆粒的穩健制造和使用來彌補這一差距。我們使用優化的微流體平臺，高效地將核酸(如siRNA、mRNA、質粒DNA)以適合管理的規模，在體外難以轉染的細胞和動物模型中進行包裝和遞送。
在這里，我們提供了這些LNPs在初級皮質大鼠neu- rons中高效細胞攝取的證據，以及它們傳遞核酸有效載荷的能力，這些能力允許:通過siRNA介導的降解下調靶向mRNA，表達外源性mRNA序列，以及外源性表達克隆到質粒中的基因。這些LNPs能夠達到高轉化率的效率，沒有可測量的相關毒性。我們還提供了初步的數據，詳細說明了在紋狀體注射后使用質粒DNA-LNPs在體內表達基因的效率
總的來說，這些研究為建立有效地將小(siRNA)和大核酸(mRNA，質粒DNA)傳遞給原始細胞用于治療的策略提供了有價值的見解。在此基礎上，我們通過優化LNP傳遞方法，為高效傳遞CRISPR-Cas9系統的導RNA和表達Cas9提供了一個合適的框架。

通過脂質納米顆粒傳遞基因
脂質納米粒(LNPs)是一個平臺，可以用來傳遞核酸到細胞。LNPs模擬低密度脂蛋白(LDLs)，由內源性途徑攝取。LNPs對pH值敏感，其設計目的是將其有效載荷釋放到細胞質中。

體外環境

1.NanoAssemblr^TMSpark反應器 2.吸取RNA和Neuro9溶液 3.插入Spark,點擊“開始”4.吸出加到細胞里

體內環境

1.準備核酸溶液解凍Neuro9混合液 裝入單獨的注射器
2.把注射器放入NanoAssemblr Benchtop ,運行程序3min
3.用離心過濾或透析凈化
4.直接注射或全身給藥

Methods

1、原代大鼠皮層神經元培養
E18大鼠皮質組織購自BrainBits, LLC.，將皮質從運輸介質中取出，用0.25%的色氨酸進行色氨酸染色trypsin-EDTA (ThermoFisher)。然后在DMEM (ThermoFisher)中用10%的FBS洗滌組織，使胰蛋白酶- eda失活，其次是DMEM。組織在神經介質(NeuroCult?Neuronal base Medium (StemCell))和NeuroCult?中研磨，SM1神經元補體(干細胞)和l -谷氨酰胺(干細胞)補充l -谷氨酸(Sigma)，然后通過40μm細胞形成一個細胞懸液過濾器。然后將該懸浮液計數并鍍在PDL涂層培養板或玻璃上，密度為4.8 x 104個細胞/平方厘米。每3-4天，一半的介質用不含L-谷氨酸的神經元介質更換一次。
2、LNPs治療大鼠原代皮層神經元
7天后(DIV7) 5μg /ml的ApoE在指定劑量的LNP被添加。然后神經元孵育48小時后收獲，進行終點評估。
3、流式細胞儀
用上述指定的LNP處理和孵育后，用PBS沖洗神經元，然后用0.25%的胰蛋白酶- edta色氨酸處理將它們從培養皿中分離出來。用3% FBS滅活PBS中的胰蛋白酶，使神經元失活
三聚體形成單細胞懸浮體然后用PBS將神經元球團洗凈，再懸浮于懸浮液中加入緩沖液(BD biosciences)和碘丙鈉(BD biosceinces)對凋亡細胞進行染色。懸浮的染色神經元然后通過35μm細胞過濾器,然后加入使用BDCelesta 流式細胞分析儀。
4、可行性分析
根據制造商的說明，PrestoBlue?細胞活性試劑(ThermoFisher)中包含的標準協議，值被校準到含有不含神經元介質的介質管中。
5、免疫細胞化學
在此評估中，將神經元置于涂有PDL涂層的蓋玻片上，然后進行培養、處理和孵育，用PBS洗滌，4% PFA固定神經元，用0.1% trton - x對神經元進行滲透，然后用NDS阻斷，然后用MAP2抗體(Sigma M4403)孵育1小時。然后在NGS中阻斷神經元，然后進行孵育與GFP抗體(AbCam ab13970)在NGS過夜。然后加入二級抗體，AlexaFluor-594用于MAP2和alexafluor GFP - 488。蓋玻片安裝在玻璃載玻片上使用extended?鉆石防褪色貼片(Thermofisher)，在共焦顯微鏡上成像。通過實驗證實了第一和第二抗體的選擇性結合沒有主控件(數據未顯示)
6、RNA提取和RT-qPCR
在對神經元進行處理和孵育后，使用PureLink?RNA Mini Kit RNA提取試劑盒預成型RNA提取(hermoFishe)按照制造商的說明。使用NanoDrop (ThermoFisher)進行RNA濃度測定和然后使用相同數量的RNA進行cDNA轉換，使用 SuperScript IV VILO Master Mix (ThermoFisher) 說明書指導。采用TaqMan引物和探針對目標mRNA和從IDT獲得ActB進行RT-qPCR， iTaq Universal Probes Supermix master mix (BioRad)，在BioRad CFX96運行熱循環(BioRad)，每個PCR三個重復。使用??Ct方法將靶mRNA的表達值歸一化為ActB值。

mRNA在大鼠原代神經元中的傳遞



注：MAP2陽性神經元(紅色)經Neuro9 GFP mRNA-LNP 5μg /毫升ApoE的處理后表達GFP(綠色).胞用抗map2一抗/alexa fluor-594偶聯二抗和抗GFP一抗/alexa fluor-488偶聯二抗染色.核用DAPI染色(藍色)


大鼠原代神經元在5μg /mLApoE存在的情況下經過Neuro9 GFP mRNA-LNP處理48 h后，流式細胞儀分析DIV 7,顯示> 95%的神經元吸收了LNP(計算使用納米顆粒內的熒光探針并encorporated)即使在不同的治療劑量的GFP mRNA LNP使用(數據沒有顯示)。

1. 的百分比GFP+神經元呈劑量依賴性，其中1 ug/mL的比例最高。
2. 平均熒光強度(MFI)最高的GFP mRNA劑量1μg / mL,每個處理n = 3,單向方差分析與Dunnett多個比較測試,* * p < 0.005, p < 0.05

1. 使用PrestoBlue?細胞活力試劑檢測細胞活力。在使用任何劑量時均未觀察到毒性，n=6為每個治療的單因素方差分析(Dunnett’s multiple)比較測試
2. 封裝不同mRNA的納米顆粒的尺寸和多分散性指數(PDI)具有可比性。GFP mRNA全長996個核苷酸，Cas9 mRNA全長4479個核苷酸長度。盡管使用不同長度的mRNA，但粒徑和PDI沒有顯著差異,學生測試

質粒在大鼠原代神經元中的傳遞



MAP2陽性神經元(紅色)經Neuro9 GFP處理后表達GFP(綠色)plasmid-LNP 5μg /毫升ApoE的存在，細胞用抗map2一抗/alexa fluor-594偶聯二抗和抗gfp一抗/alexa fluor-488偶聯二抗染色，核用DAPI染色(藍色)



流式細胞儀分析在Neuro9 GFP plasmid-LNP存在下治療48 h后的情況5μg /毫升ApoE在鼠初級神經元,DIV 7,顯示> 95%的神經元表現出lnp的吸收(用熒光探針計算，納米顆粒內確實有包裹)用不同劑量的GFP質粒處理(數據未顯示)

1. GFP neruons呈劑量依賴性，其中0.6ug/mL的比例最高。
2. 在GFP MFI中也觀察到這種劑量反應模式，n=3表示每次治療的單因素方差分析Dunnett's多重比較檢驗，**** p<0.0001， ** p<0.005

1. 使用PrestoBlue?細胞活力試劑檢測細胞活力。任何劑量均未觀察到毒性，每次治療n=6，單因素方差分析與Dunnett’s倍數比較測試
2. 包覆不同質粒的納米顆粒大小和PDI具有可比性。盡管使用不同大小的質粒，顆粒大小和PDI沒有顯著差異，學生的t-test

質粒在體內的傳遞



10個月大的FVB小鼠，皮下注射GFP plasmid-LNP，48H后GFP表達(綠色)。注入5μl 3mg/ml GFP plasmid-LNP。用DAPI染色(藍色)細胞核，用DiD染色(紅色)的LNP，GFP表達(綠色)在相同的區域上。LNP的攝取和GFP的表達均在注射區域內定位紋狀體，并已擴散到包括心室部分在內的周圍增生性區域系統和胼胝體。

小RNA在大鼠原代神經元中的傳遞

A)使用Neuro9 siRNA-LNP處理48 h后流式細胞術分析，5μg /毫升ApoE存在鼠主要神經元中,DIV 7,顯示> 95%的神經元顯示吸收的脂質納米顆粒(使用熒光探針計算納米顆粒內的包殼)
B)使用PrestoBlue?細胞活力試劑檢測細胞活力。在有效劑量為5倍的情況下，未觀察到毒性，采用單因素方差分析和 Dunnett’s 多重比較試驗。



C) siRNA LNP劑量在1μg /ml的產品，同時使用IDT和Dharmacon的siRNAs，靶向mRNA75%擊倒，每個處理n=3，與Dunnett的單因素方差分析多重比較檢驗，**** p<0.0005。
D) C) 封裝不同siRNA的納米顆粒的大小和PDI 比較，盡管使用不同大小的siRNAs，但顆粒大小和PDI沒有顯著差異。

結論

1. NanoAssembly?平臺能夠創建攜帶siRNA、mRNA或質粒有效載體高度可重現性的LNPs
2. 這些LNPs在原代、大鼠、皮層神經元可以有效地傳遞（>95%），并且允許相關的payloads高效傳遞
3. 即使在高劑量時，LNPs對這些初級神經元也沒有毒性(50x)

我們的研究結果證實，這些脂質納米粒可以作為一種CRISPR-Cas9組分到介導基因的有效的傳遞系統使用

LNP-mediated CRISPR-Cas9傳遞
LNPs具有多種功能，可以通過mRNA、pDNA或預先形成的核糖體蛋白復合物來傳遞Cas，一個或多個導向股也可以很好傳遞


實驗儀器：

NanoAssemblr^TMSpark納米顆粒合成系統 （點擊此處打開產品鏈接）



NanoAssemblr Benchtop納米顆粒合成系統 （點擊此處打開產品鏈接）

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