細胞培養常見問題及回答-自主發布-資訊-生物在線

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細胞培養常見問題及回答

作者：北京鴻躍科技有限公司 2012-06-05T00:00 (訪問量:27359)

細胞培養常見問題及回答

1.如何選用培養基？

培養某一類型細胞沒有固定的培養條件。在MEM中培養的細胞，很可能在DMEM或M199中同樣很容易生長?？傊?，首選MEM做粘附細胞培養、RPMI-1640做懸浮細胞培養，各種目的無血清培養的首選是AIM V培養基（SFM）。在開始進行新的細胞培養時，可以參考下表所列的條件：

細胞系	細胞類型	種	組織	推薦使用的培養基
293	成纖維細胞	人	胚胎腎	MEM, 10% 熱滅活馬血清
3T6	成纖維細胞	小鼠	胚胎	DMEM, 10% 胎牛血清
A549	上皮細胞	人	肺癌	F-12K, 10%胎牛血清
A9	成纖維細胞	小鼠	結締組織	DMEM, 10%胎牛血清
AtT-20	上皮細胞	小鼠	垂體腫瘤	F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
BALB/3T3	成纖維細胞	小鼠	胚胎	DMEM, 10% 胎牛血清
BHK-21	成纖維細胞	倉鼠	腎	GMEM, 10% 胎牛血清或MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
BHL-100	上皮細胞	人	乳房	McCoy'5A, 10% 胎牛血清
BT	成纖維細胞	牛	鼻甲骨細胞	MEM, 10% 胎牛血清和 NEAA
Caco-2	上皮細胞	人	結腸腺癌	MEM, 20% 胎牛血清和NEAA
Chang	上皮細胞	人	肝臟	BME, 10% 小牛血清
CHO-K1	上皮細胞	倉鼠	卵巢	F-12, 10% 胎牛血清
Clone 9	上皮細胞	大鼠	肝臟	F-12K, 10% 胎牛血清
Clone M-3	上皮細胞	小鼠	黑素瘤	F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
COS-1	成纖維細胞	猴	腎	DMEM, 10% 胎牛血清
COS-3	成纖維細胞	猴	腎	DMEM, 10% 胎牛血清
COS-7	成纖維細胞	猴	腎	DMEM, 10% 胎牛血清
CRFK	上皮細胞	貓	腎	MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
CV-1	成纖維細胞	猴	腎	MEM, 10% 胎牛血清
D-17	上皮細胞	狗	骨肉瘤	MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
Daudi	成淋巴細胞	人	淋巴瘤病人血液	RPMI-1640, 10% 胎牛血清
GH1	上皮細胞	大鼠	垂體腫瘤	F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
GH3	上皮細胞	大鼠	垂體腫瘤	F-10, 15% 馬血清和2.5% 胎牛血清
H9	成淋巴細胞	人	T細胞淋巴瘤	RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HaK	上皮細胞	倉鼠	腎	BME, 10% 小牛血清
HCT-15	上皮細胞	人	結腸直腸腺癌	RPMI-1640, 10% 胎牛血清
HeLa	上皮細胞	人	子宮頸癌	MEM, 10% 胎牛血清和NEAA (in suspension, S-MEM)
HEp-2	上皮細胞	人	喉癌	MEM, 10% 胎牛血清
HL-60	成淋巴細胞	人	早幼粒細胞白血病	RPMI-1640, 20% 胎牛血清
HT-1080	上皮細胞	人	纖維肉瘤	MEM, 10% HI 胎牛血清和NEAA
HT-29	上皮細胞	人	結腸腺癌	McCoy's 5A, 10% 胎牛血清
HUVEC	內皮細胞	人	臍帶	F-12K, 10% 胎牛血清和肝素鹽 100 ug/ ml
I-10	上皮細胞	小鼠	睪丸癌	F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清
IM-9	成淋巴細胞	人	骨髓瘤病人骨髓	RPMI-1640, 10% 胎牛血清
JEG-2	上皮細胞	人	絨毛膜癌	MEM, 10% 胎牛血清
Jensen	成纖維細胞	大鼠	肉瘤	McCoy's 5A, 5% 胎牛血清
Jurkat	成淋巴細胞	人	淋巴瘤	RPMI-1640, 10% 胎牛血清
K-562	成淋巴細胞	人	骨髓性的白血病	RPMI-1640, 10% 胎牛血清
KB	上皮細胞	人	口腔癌	MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
KG-1	骨髓白細胞	人	紅白血病病人骨髓	IMDM, 20% 胎牛血清
L2	上皮細胞	大鼠	肺	F-12K, 10%胎牛血清
L6		大鼠	骨骼肌成肌細胞	DMEM, 10% 胎牛血清
LLC-WRC 256	上皮細胞	大鼠	癌	Medium 199, 5% 馬血清
McCoy	成纖維細胞	小鼠	未知	MEM, 10% 胎牛血清
MCF7	上皮細胞	人	乳腺癌	MEM, 10% 胎牛血清 NEAA, 10ug/ml 胰島素
WEHI-3b	類巨噬細胞	小鼠	骨髓單核細胞白血病	DMEM, 10% 胎牛血清
WI-38	上皮細胞	人	胚胎肺	BME, 10% 胎牛血清
WISH	上皮細胞	人	羊膜	BME, 10% 胎牛血清
WS1		人	胚胎皮膚	MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
XC	上皮細胞	大鼠	肉瘤	MEM, 10% 胎牛血清和NEAA
Y-1	上皮細胞	小鼠	腎上腺瘤	F-10, 15% 馬血清和 2.5% 胎牛血清

2.為什么要熱滅活血清？

加熱可以滅活補體系統。激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞、昆蟲細胞和平滑肌細胞時，推薦使用熱滅活血清。

3.L－谷氨酰胺在細胞培養中重要嗎？它在溶液中不穩定嗎？

L－谷氨酰胺在細胞培養時是重要的。脫掉氨基后，L－谷氨酰胺可作為培養細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L－谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終確定。L－谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

4.GlutaMAX-I是什么？培養細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩定？

GlutaMAX-I二肽是L－谷氨酰胺的衍生物，將其不穩定的α－氨基用L－丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L－谷氨酰胺供利用。
GlutaMAX-I二肽非常穩定，即使在121磅滅菌20分鐘，GlutaMAX-I二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L－谷氨酰胺幾乎完全降解。

5.為什么培養基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養基中被用來作為PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養細胞，尤其是哺乳類細胞時，用不加酚紅的培養基。由于酚紅干擾檢測，一些研究人員在做流式細胞檢測時，不使用加有酚紅的培養基。

6.如何用臺盼蘭計數活細胞？

用無血清培養基把細胞懸液稀釋到200－2000個/毫升，在0.1毫升的細胞中加入0.1毫升的0.4％的臺盼蘭溶液。輕輕混勻，數分鐘后，用血球計數板計數細胞?；罴毎懦馀_盼蘭，因而染成藍色的細胞是死細胞。

7.如何消除組織培養的污染？

當重要的培養污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。
高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養污染的實驗步驟。
1 在無抗生素的培養基中消化、計數和稀釋細胞，稀釋到常規細胞傳代的濃度。
2 分散細胞懸液到多孔培養板中，或幾個小培養瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0,8.0 mg/ml。
3 每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現空泡，匯合度下降和變圓。
4 確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2－3倍濃度的抗生素的培養液培養細胞2－3代。
5 在無抗生素的培養基中培養細胞一代。
6 重復步驟4。
7 在無抗生素的培養基中培養4－6代，確定污染是否以已被消除。

8.培養基中丙酮酸鈉的作用是什么？

丙酮酸鈉可以作為細胞培養中的替代碳源。盡管細胞更傾向于以葡萄糖作為碳源，但是，如果沒有葡萄糖的話，細胞也可以代謝丙酮酸鈉。

9.為什么儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉淀？

GIBICO的胎牛血清沒有預老化，儲存在2－8℃時，血清中的各種蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。推薦在－20℃儲存胎牛血清，避免反復凍融。

10.目錄上說，Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）要在空氣中使用，不需要CO₂培養箱。原因是什么？
Hank’s 平衡鹽溶液（HBS）和Earle’s平衡鹽溶液（EBS）有什么本質的功能差別？

HBS和 EBS 的主要差別在于碳酸氫鈉的水平，碳酸氫鈉的含量在Eagles (2.2g/L)中比在Hanks (0.35g/L) 中高。碳酸氫鈉需用高水平的CO₂平衡，以維持溶液的PH值。Eagles液在空氣水平的CO₂ 中，溶液會變堿，Hanks液在CO₂培養箱中會變酸。如果希望在CO₂培養箱中保存組織，需要用Eagles液。如果僅僅是清洗將要在細胞培養基中儲存的組織，用Hanks液就可以了。

11.Qualified和 Certified 胎牛血清有什么差別?

Certified 胎牛血清包括了Qualified 胎牛血清執行的所有的標準檢驗程序，而且除了這些標準檢測，Certified胎牛血清還有如下一些附加的檢測：
End-Point Determination of Endotoxin Content
噬菌體檢驗
生物化學檢測
激素的檢測
血紅蛋白檢測
Sf9 細胞生長促進及方法學檢測

12.二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎？使用胰蛋白酶時加入EDTA的目的是什么？

二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細胞前，用EDTA清洗細胞，以消除來自培養基中所有的二價離子。

13.制備 lipid-DNA的方法會影響轉染效率嗎？

是的。對于LIPOFECTAMlNE Reagent，稀釋試劑在100μl OPTI-MEM中，稀釋DNA在100μl OPTI-MEM中?；旌蟽煞N溶液在室溫下孵育15分鐘。對于LIPOFECTIN Reagent，在加入DNA溶液前允許稀釋的試劑和培養基孵育至少30分鐘可以增加3倍的效率。確保復合物在沒有血清的情況下形成。孵育15分鐘后，在復合物中加入含有血清的培養基（800μl）。（注意以上是35mm培養皿使用體積）。對于LIPOFECTAMlNE Plus Reagent DNA應該在與脂質體混合之前首先與Plus Reagent混合。LIPOFECTAMlNE 2000的操作步驟允許在一個很小的體積下混合DNA和脂質體，接下來可以不需要換培養基的情況下直接加入。對于每一種脂質體的詳細的信息可以參考產品說明書。

14.我使用SF900 Ⅱ時，細胞生長良好，但是為什么我的蛋白產物不如使用Graces 液和10%胎牛血清時效果好？

如果目的蛋白是一個后期蛋白，它將與蛋白酶一起表達，這些蛋白酶將會作用于目的蛋白。在加有血清的培養基中，這些蛋白酶將作用到血清中的蛋白，從而使目的蛋白產品保持完好。在無血清配方中，蛋白酶作用的唯一底物是你的目的蛋白。為了避免這一問題，加入一些蛋白酶抑制劑或加入少量的血清（少于1％），讓血清給蛋白酶提供作用底物。

15.如何檢測內毒素(熱源)水平？

LAL（Limulus Amebocyte Lysate）試驗是可用的最敏感和特異的檢測細菌內毒素的方法。Levin和Bang 發現細菌可引起鱟（Limulus polyphemus）血管內的凝集作用。內毒素啟動一個細胞內酶原系統（絲氨酸蛋白酶級聯反應系統），通過修飾凝集素，產生一種透明的膠，LAL中的凝固蛋白，從而，形成不可溶的基質。LAL試劑緩沖的鱟（血細胞）裂解物。
胎牛血清的內毒素檢測是在Grand Island，按照手冊上Gel-clot 方法進行的。在對血清產品進行內毒素檢測前，用無熱源的水1：10稀釋樣品。稀釋樣品沸水育5分鐘，以消除抑制劑。（通常，血液中的內毒素結合成份的出現會抑制凝膠過程，使內毒素不能與LAL反應。樣品預先熱處理可以消除這種抑制作用。）

16.我可以使用固體形式的Murashige Skog 培養基嗎？

如果使用固體形式的培養基，需要加入瓊脂。瓊脂加入前要先滅菌。應該避免MS培養基的直接滅菌，應該高壓滅菌瓊脂溶液，然后把融化的瓊脂溶液加入到MS培養基中。

17.20℃下配制的緩沖液，在較高或較低的溫度下PH值會改變嗎？

對于普通使用的緩沖液，PH值隨溫度變化而變化。
下表列出溫度改變10℃時，PH值的變化情況
例如 20℃下配制PH7.4 Tris緩沖液,40℃時PH值為 7.4-（2x0.310）＝6.78

緩沖系統	pKa/20℃	[Delta]pKa/10℃
Mes	6.15	-0.110
Ada	6.60	-0.110
Pipes	6.80	-0.085
Aces	6.90	-0.200
Bes	7.15	-0.160
Mops	7.20	-0.013
Tes	7.50	-0.200
Hepes	7.55	-0.140
Tricine	8.15	-0.210
Tris	8.30	-0.310
Bicine	8.35	-0.180
Glycylglycine	8.40	-0.280

18.室溫下(25℃)配制的Tris-HCl溶液，在37℃使用時PH值是多少？

緩沖液的PH值隨溫度變化而變化。下表列出了50mM Tris-HC 溶液在4℃，25℃，37℃時，不同的PH值。

4℃	25℃	37℃
8.1	7.5	7.2
8.2	7.6	7.3
8.3	7.7	7.4
8.4	7.8	7.5
8.5	7.9	7.6
8.6	8.0	7.7
8.7	8.1	7.8
8.8	8.2	7.9
8.9	8.3	8.0
9.0	8.4	8.1
9.1	8.5	8.2
9.2	8.6	8.3
9.3	8.7	8.4
9.4	8.8	8.5

19.昆蟲細胞培養的最適PH值和滲透壓是多少？

生長培養基的PH值對細胞的增值和病毒或重組蛋白的生產均會產生影響。對于大部分鱗翅類昆蟲細胞系，在PH值 6.0－6.4范圍的大部分應用效果良好。培養鱗翅類昆蟲細胞系時，培養基的最適滲透壓是 345－380mOsm/kg.。為保證可靠和持久的細胞培養方式，減少技術問題，保持PH值和滲透壓在以上所列的范圍之內。

20.High Five細胞有任何其它名稱嗎？

High Five細胞也被稱為Trichoplasia ni 5B1-4和BTI-TN-5B1-4。

21.PFHM-II 和HYBRIDOMA-SFM之間有什么差別？

PFHM-II (Protein-free Hybridoma Medium)是不包含有蛋白質的單克隆抗體生產培養基。如果作為雜交瘤生產培養基使用，PFHM-II可能需要補充低水平的血清。HYBRIDOMA-SFM即是雜交瘤生產培養基，也是單克隆抗體生產培養基。它包含低水平的蛋白質。

22.在High Five無血清培養基中去污劑的濃度是多少？

High Five無血清培養基中去污劑的濃度：0.025 g/L Tween-80，1.0 g/L Pluronic Poly-all。

23.High Five細胞用多大的密度凍存？

3.0x10E6 cells/ml

24.在我的果蠅培養基中發現形成白色沉淀，加熱后溶解。它是什么？對我的細胞有害嗎？

可能是谷氨酰胺沉淀，但是更可能是L-酪氨酸沉淀。培養基中谷氨酰胺的濃度比典型的2mM高6倍。酪氨酸的濃度比在RPMI 1640中高25倍，而且比谷氨酰胺更加難以溶解。沉淀也可能是不止一種成分的復合物。它可能是由于貯存在局部溫度較低的地方引起。只要沉淀在培養條件下可以溶解，對實驗不會有不利的影響。

25.如何從T25瓶中轉移sf9細胞？能用胰蛋白酶消化嗎？

我們強力推薦使用脫落細胞的方法，因為這項技術破壞性最小，生活力最高。正如手冊上所顯示，通過使用巴氏德吸液管，讓細胞上培養基流動。作為一種選擇你也可以輕輕拍打培養瓶。只有在絕對必要的情況下，才使用胰酶消化細胞。
胰酶消化一個T25瓶的sf9細胞：
1. 去除培養基。
2. 用2ml 1xPBS（足以覆蓋細胞表面）洗滌細胞，去除PBS.
3. 加入2ml 1x胰酶EDTA（恰好覆蓋細胞表面）。
4. 37 ℃孵育5到10分鐘。在儀器下檢測看到5分鐘后它們正在向上移動。
5. 向細胞中加入2ml 細胞培養液，移入錐形管，用2ml培養液洗瓶壁，移入同一錐形管中。（培養基中的FBS終止了胰酶的活性。）
6. 離心（1100rpm）沉淀細胞。去除培養基。
7. 用新的培養基重新懸浮細胞。傳代。

26.在Sf9, Sf21, 和high Five細胞懸浮培養時，肝素的使用量是多少？

為了防止懸浮培養細胞聚集的形成，使用肝素濃度為10單位/毫升細胞懸液。

27.如何評估ES細胞合格的胎牛血清？

使用D3 ES細胞。這是一個對于胎牛血清中生長促進、生長抑制和分化因子非常敏感的細胞系。
相關生長效率分析：
當ES細胞以非常低的密度傳入包含10％胎牛血清的生長培養基中，檢測開始和支持ES細胞克隆的能力。
細胞毒分析：
當以非常低的密度傳入包含30％胎牛血清的生長培養基中，檢測ES細胞和feeder細胞的生長能力。
相關形態學和分化分析：
檢測胎牛血清支持未分化ES細胞克隆的能力。通過堿性磷酸酶活性評估分化程度。未分化的ES細胞小顏色深紅粉紅，分化的細胞較大，豐滿，顏色較淺。
所有的分析在沒有ESGRO的情況下進行的，培養基中出現ESGRO會掩蓋由胎牛血清所導致的問題。（ESGRO或LIF經常用來保持ES細胞處于未分化狀態。）
經過培養發現，大約8批中有1批可以用來培養ES細胞。

28.在重新凍存sf9細胞前，它可以傳多少代？隨著傳代的次數的增加，它的感染能力會降低嗎？

通常情況當細胞經過30次傳代后，應該返回凍存。無論什么時候記數時，都應該檢查細胞活力。如果超過95％的細胞保持有活力和在大約30小時左右加倍，細胞仍然可以使用。如果活力和加倍時間下降，它們的感染力將不在是有效的。

細胞培養FAQ

細胞培養FAQ

1 冷凍管應如何解凍？
取出冷凍管后，須立即放入37 °C 水槽中快速解凍，輕搖冷凍管使其在1 分鐘內全部融化，并注意水面不可超過冷凍管蓋沿，否則易發生污染情形。另冷凍管由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全，預防冷凍管之爆裂。

2 細胞冷凍管解凍培養時，是否應馬上去除DMSO？
除少數特別注明對DMSO 敏感之細胞外，絕大部分細胞株（包括懸浮性細胞），在解凍之后，應直接放入含有10-15ml新鮮培養基之培養角瓶中，待隔天再置換新鮮培養基以去除DMSO 即可，如此可避免大部分解凍后細胞無法生長或貼附之問題。

3 可否使用與原先培養條件不同之培養基？
不能。每一細胞株均有其特定使用且已適應之細胞培養基，若驟然使用和原先提供之培養條件不同之培養基，細胞大都無法立即適應，造成細胞無法存活。

4 可否使用與原先培養條件不同之血清種類？
不能。血清是細胞培養上一個極為重要的營養來源，所以血清的種類和品質對于細胞的生長會產生極大的影響。來自不同物種的血清，在一些物質或分子的量或內容物上都有所不同，血清使用錯誤常會造成細胞無法存活。

5 何謂FBS, FCS, CS, HS ?
FBS (fetal bovine serum) 和FCS (fetal calf serum) 是相同的意思，兩者都是指胎牛血清， FCS 乃錯誤的使用字眼，請不要再使用。CS (calf serum) 則是指小牛血清。HS (horseserum) 則是指馬血清。

6 培養細胞時應使用5 % 或10% CO2？或根本沒有影響？
一般培養基中大都使用HCO3-/CO32-/H+ 作為pH 的緩沖系統，而培養基中NaHCO3 的含量將決定細胞培養時應使用的CO2 濃度。當培養基中NaHCO3 含量為每公升3.7 g 時，細胞培養時應使用10 % CO2；當培養基中NaHCO₃ 為每公升1.5 g 時，則應使用5 % CO2 培養細胞。

7 何時須更換培養基？
視細胞生長密度而定，或遵照細胞株基本數據上之更換時間，按時更換培養基即可。
8 培養基中是否須添加抗生素？除于特殊篩選系統中外，一般正常培養狀態下，培養基中不應添加任何抗生素。

9 附著性細胞繼代時所使用之trypsin-EDTA 濃度？應如何處理？
一般使用之trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53mMEDTA.4 Na。第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于–20 °C，避免反復冷凍解凍造成trypsin 之活性降低，并可減少污染之機會。

10 懸浮性細胞應如何繼代處理？
一般僅需持續加入新鮮培養基于原培養角瓶中，稀釋細胞濃度即可，若培養液太多時，可將培養角瓶口端稍微抬高，直到無法容納為止。分瓶時取出一部份含細胞之培養液至另一新的培養角瓶，加入新鮮培養基稀釋至適當濃度，重復前述步驟即可。

11 欲將一般動物細胞離心下來，其離心速率應為多少轉速？
欲回收動物細胞，其離心速率一般為300xg (約1,000rpm)，5 - 10 分鐘，過高之轉速，將造成細胞死亡。

12 細胞之接種密度為何？

依照細胞株基本數據上之接種密度或稀釋分盤之比例接種即可。細胞數太少或稀釋的太多亦是造成細胞無法生長之一重要原因。

13 細胞冷凍培養基之成份為何？
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 % 原來細胞生長用之新鮮培養基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配制完成。

14 DMSO 之等級和無菌過濾之方式為何？
冷凍保存使用之DMSO 等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應立即少量分裝于無菌試管中，保存于4°C，避免反復冷凍解凍造成DMSO 之裂解而釋出有害物質，并可減少污染之機會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO 之Nylon 材質濾膜。

15 冷凍保存細胞之方法？
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4 °C 30~60 分鐘→ (-20 °C30 分鐘*) → -80 °C 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設定程序之可程序降溫機中每分鐘降1-3 °C 至–80 °C 以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20 °C 不可超過1 小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡，亦可跳過此步驟直接放入-80°C 冰箱中，惟存活率稍微
降低一些。

16 細胞欲冷凍保存時，細胞冷凍管內應有多少細胞濃度？
冷凍管內細胞數目一般為1x10⁶cells/ml vial，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。

17 應如何避免細胞污染？

細胞污染的種類可分成細菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉漿菌。主要的污染原因為無菌操作技術不當、操作室環境不佳、污染之血清和污染之細胞等。嚴格之無菌操作技術、清潔的環境、與品質良好之細胞來源和培養基配制是減低污染之最好方法。

18 如果細胞發生微生物污染時，應如何處理？
直接滅菌后丟棄之。

19 支原體(mycoplasma) 污染的細胞，是否能以肉眼觀察出異狀？
不能。除極有經驗之專家外，大多數遭受支原體污染的細胞株，
無法以其外觀分辨之。

20 支原體污染會對細胞培養有何影響？
支原體污染幾乎可影響所有細胞之生長參數，代謝及研究之任一數據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果之數據方有意義。

21 偵測出細胞株有支原體污染時，該如何處理？
直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株。

22 CO2 培養箱之水盤如何保持清潔？
定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

23 為何培養基保存于4 °C 冰箱中，顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？
培養基保存于4 °C 冰箱中，培養基內之CO2 會逐漸溢出，造成培養基越來越偏堿性。而培養基中之酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養基偏堿之結果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養基偏堿時，可以通入無菌過濾之CO2，以調整pH 值。

24 各種細胞培養用的dish，flask是否均相同？
不同廠牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數細胞則可能因使用廠牌不同之dish 或flask 而有顯著之生長差異。

25 購買之細胞冷凍管經解凍后，為何會發生細胞數目太少之情形？
研究人員在冷凍細胞之培養時出現細胞數目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養基即可。

26 購買之細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？
研究人員在細胞培養時出現存活率不佳，常見原因可歸納為：培養基使用錯誤或培養基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養溫度使用錯誤。細胞置于–80 °C 太久。

27 收到之冷凍管瓶身破裂，瓶蓋有裂紋，或瓶蓋脫落之原因？
冷凍管瓶蓋裂紋，或瓶身破裂，可能是因為操作者夾取冷凍管時用力不當，造成冷凍管裂損，建議使用止血鉗小心夾取。另冷凍管瓶蓋松動或松脫，乃因熱脹冷縮之物理現象，冷凍管有可能因此而造成細胞污染，故冷凍管于放入和取出液氮桶時，均應立刻將冷凍管再一次扭緊

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