?
行為靈活性（Behavioral flexibility）是一種根據不斷變化的環境或突發事件作出調整的重要能力，在多數神經精神類疾病如自閉癥、精神分裂癥、強迫癥和遲發性癡呆等疾病中存在，且在衰老過程中也會伴隨著靈活性和認知缺陷。然而，衰老過程中行為靈活性受損的潛在機制尚不清楚。
近日，華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院病理生理學系朱玲強教授團隊在Molecular Psychiatry雜志發表研究論文“Social isolation reinforces aging-related behavioral inflexibility by promoting neuronal necroptosis in basolateral amygdala”。研究借助快速老化SAMP8小鼠模型，首次揭示老年行為靈活性障礙的分子機制，發現糖原合酶激酶-3（GSK-3α）調控mTORC1信號通路參與基底外側杏仁核（basolateral amygdala, BLA）神經元程序性壞死及行為靈活性障礙。同時研究還揭示了目前老年人中普遍存在的生活方式—獨居是老年行為靈活性障礙的高危因素，并提出了可能的干預策略。
結果
衰老小鼠BLA神經元活性降低，表現行為靈活性障礙
首先，研究者借助基于氣味刺激的反轉學習行為學范式測試5月齡快速老化SAMP8小鼠的行為靈活性：小鼠選擇氣味1時給予食物獎賞，選擇氣味2時無獎賞，待小鼠的正確選擇達到一定標準后，進行反轉學習測試，小鼠選擇氣味1時無獎賞，選擇氣味2時給予獎賞（圖1A,B），結果顯示，5月齡SAMP8小鼠在反轉學習過程中需要更多次的訓練才能達到標準（圖1C,D），表現出行為靈活性障礙。此外，在延遲折扣行為范式中，SAMP8小鼠同樣表現出類似的癥狀（圖1F,G）。
眶額皮質（orbitofrontal cortex, OFC）、杏仁核（amygdala）和后梨狀皮層（posterior piriform cortex, PPC）是基于氣味刺激的反轉學習的三個重要腦區，同時，伏隔核（nucleus accumbens, NAc）、OFC、內側前額葉皮層（medial prefrontal cortex, mPFC）和杏仁核參與延遲折扣行為（圖1H）。基于此，研究者借助c-fos和Egr1染色發現BLA神經元活性降低，提示了BLA可能參與調節SAMP8小鼠的行為靈活性（圖1H-J）。此外，電生理記錄結果顯示，反轉學習過程中，SAMP8小鼠BLA自發局部場電位（local field potential, LFP）中Theta 振蕩減弱（圖1K-P），提示了BLA神經元活性降低，功能受損。
圖1 SAMP8小鼠BLA神經元活性降低，表現行為靈活性障礙
?
BLA神經元程序性壞死參與衰老小鼠行為靈活性障礙
接下來，研究者借助Nissl染色和免疫組化發現，SAMP8小鼠BLA神經元丟失以及突觸素（synaptophysin, SYP）表達降低（圖2A-C）。有趣的是，老年食蟹猴腦中也發現杏仁核神經元丟失的現象（圖2D-F）。
細胞凋亡和細胞壞死是細胞死亡的兩種主要模式，研究者發現SAMP8小鼠和SAMR1小鼠（抗快速老化小鼠）的凋亡信號相關蛋白的表達無明顯差異，然而，程序性細胞壞死相關信號蛋白RIPK3，pRIPK3，MLKL和pMLKL的表達顯著增加（圖2G,H），且SAMP8小鼠BLA神經元pMLKL膜轉位明顯，提示細胞壞死（圖2I,J）。通過腹腔注射Nec-1s（選擇性壞死性凋亡抑制劑）后，發現可明顯改善SAMP8小鼠BLA神經元死亡及行為靈活性障礙（圖2M-P）。這些結果提示了程序性細胞壞死參與老年小鼠的神經元死亡及行為靈活性障礙。
圖2 BLA神經元程序性壞死參與老年小鼠行為靈活性障礙
?
GSK-3α調控mTORC1信號通路參與衰老小鼠行為靈活性障礙
基于上述結果，研究者進一步研究介導老年小鼠BLA神經元壞死的潛在分子機制。借助mRNA微陣列（mRNA microarrays） 發現SAMP8小鼠中存在8個基因顯著下調（圖3A），其中GSK-3α（糖原合酶激酶-3）是僅有一個被報道參與衰老和細胞死亡相關的基因，且在SAMPA8小鼠和老年食蟹猴杏仁核中GSK-3α表達水平明顯降低（圖3B-I），且BLA中GSK-3α的表達下調與pMLKL膜轉位高度相關（圖3J-N）。這些結果提示了GSK-3α的表達下調參與老年動物BLA神經元壞死。
隨后，研究者驗證GSK-3α與神經元壞死之間的因果關系，在GSK-3αflox/+鼠BLA注射AAV2/8- hSyn-Cre病毒，條件性敲除小鼠BLA神經元中GSK-3α基因（GSK-3α+/?，圖3O-Q），結果顯示，GSK-3α+/?小鼠BLA中RIPK3、pRIPK3、MLKL和pMLKL的表達水平顯著增加，同時表現出行為靈活性障礙（圖3R-Y）。這些結果提示了衰老小鼠BLA中GSK-3α表達下調可導致神經元壞死和動物行為靈活性障礙。
圖3 下調BLA中GSK-3α的表達導致衰老小鼠神經元壞死及行為靈活性障礙
進一步，研究者在4月齡SAMP8小鼠BLA中注射AAV2/8-hSyn-GSK-3α病毒，發現BLA神經元中過表達GSK-3α可導致SAMP8小鼠BLA中程序性細胞壞死相關信號蛋白表達水平顯著降低，并改善小鼠的行為靈活性障礙（圖4A-K）。研究者通過動物和細胞水平發現，下調GSK-3α表達可導致RIPK3蛋白水平及其磷酸化水平顯著增加（圖4L-N），提示了RIPK3降解受阻可能參與由GSK-3α表達下調誘發的神經元壞死過程。
激活的mTOR信號通路可以通過抑制自噬來減少RIPK3的降解，研究者借助分子生物學手段發現，GSK-3α+/?小鼠和老年SAMP8小鼠BLA中mTORC1信號通路被激活，自噬受損（圖4O-S），提示了mTORC1信號通路通過誘發自噬功能障礙參與老年小鼠神經元壞死過程。
圖4 上調GSK-3α的表達改善了SAMP8小鼠BLA神經元程序性壞死及靈活性受損，mTORC1信號通路通過誘發自噬功能障礙參與老年小鼠神經元壞死過程
獨居是老年行為靈活性障礙的高危因素
孤獨和社交孤立可加劇老年人或老齡動物的認知改變，那么孤獨/社交孤立是否會影響老年動物的行為靈活性呢？為解答這一問題，研究者將3月齡SAMP8小鼠分為獨居（I-SAMP8）和群居（S-SAMP8）兩組，飼養1個月（圖5A），結果顯示，獨居SAMP8小鼠BLA神經元中GSK-3α表達降低、mTORC1信號被激活、程序性細胞壞死相關信號蛋白表達顯著增加，導致神經元丟失并表現出行為靈活性障礙（圖5B-M）。隨后，通過病毒載體過表達GSK-3α后可有效改善小鼠行為靈活性障礙（圖5N-R）。這些數據提示了獨居作為目前老年人中普遍存在的生活方式，是老年行為靈活性障礙的高危因素。
圖5 獨居是老年行為靈活性障礙的高危因素
?
結論
本文基于SAMP8快速衰老小鼠，配合行為學、病毒載體介導的基因調控手段、分子生物學等多種技術手段揭示老年行為靈活性障礙的潛在分子機制：BLA神經元中GSK-3α的缺失誘發mTORC1信號通路的激活，從而促進RIPK3依賴性細胞程序性壞死，導致BLA神經元活性降低，引發行為靈活性障礙。同時研究還揭示了目前老年人中普遍存在的生活方式—獨居是老年行為靈活性障礙的高危因素，并提出了可能的干預策略。
和元生物有幸為研究者提供實驗中使用的AAV和慢病毒載體，助力神經科學研究！