重組腺相關病毒（ Recombinant adeno-associated virus, rAAV）是一種無包膜、以單鏈DNA為遺傳物質、基因組容量4.7kb的復制缺陷型微小病毒。rAAV具有多種血清型可親嗜不同靶器官，免疫原性極低安全性高，2-3周可達到表達高峰且長時間穩定表達等特點，因此，rAAV廣泛應用于動物研究、基礎研究和基因治療領域。

自互補AAV（Self-complementary AAV, scAAV）在rAAV的基礎上將其編碼區域設計成雙鏈DNA，因此scAAV感染細胞后互補部分互補形成雙鏈DNA，然后進行轉錄、翻譯，不需等待第二鏈DNA合成，取消了rAAV基因表達的限速步驟，縮短了開始表達的時間，scAAV感染后一般3-5天即可到達表達高峰。但也正是scAAV的雙鏈DNA結構，致使其容量縮小至2.1kb，因此外源目的基因大小需要控制在1kb左右。

圖1 ssAAV與scAAV肝臟表達（1E+11 VG/只，尾靜脈注射）

自互補AAV應用領域

1. 干擾靶點篩選

短發夾RNA（Short hairpin RNA, shRNA）克隆進病毒載體感染細胞后，在細胞中表達小干擾RNA（Small interfering RNA, siRNA），抑制mRNA轉錄，實現抑制目的基因表達目的。對于未知的干擾靶基因的篩選一般采取體外實驗的方式進行驗證，在細胞系上進行驗證時常會遇到體外有效果體內無效果的情況；或在原代細胞上驗證，原代細胞分離難度大、培養難度高也同樣制約了shRNA的靶基因效果驗證；常規體內篩選靶點的方式又大大的影響了研究的速度。然而，scAAV-shRNA篩選干擾靶點可以快速并且準確地獲得干擾結果，極大的加快了研究的效率。

圖2 scAAV2/8-WT1 shRNA抑制Wt1基因在腎臟表達

（Chen T L, et al., The Scientific World Journal, 2014）

2. 基因編輯

CRISPR/Cas9技術通過對基因水平操作實現基因敲除或基因定點編輯。利用病毒載體表達向導RNA（guide RNA, gRNA），配合Cas9小鼠/病毒，可以對小鼠的目的基因進行編輯。

圖3 肌肉注射AAV9基因編輯元件傳遞到D52 DMD小鼠改善營養不良蛋白表達

（Min Y L, et al., Molecular Therapy, 2020）

3. 基因敲降

Cre-LoxP重組酶體系因其特異性質，廣泛應用在基因敲除（Knock out，KO）或敲入（Knock in，KI）研究中，目前常用轉基因小鼠來實現。轉基因小鼠由于構建周期長，價格高，繁育時間久，部分基因敲除或過表達胚胎致死等原因制約了研究的順利進行，然而，病毒載體可以克服以上研究中出現的問題。scAAV-cre配合Flox小鼠使用，可在成年或幼年小鼠上實現快速基因敲降（Knock down, KD）。

圖4 scAAV-Cre在Rosa26報告小鼠肝臟中表達

（Chen S, et al., Angiogenesis, 2010）

4. 特異性標記

另外，利用Cre小鼠或scAAV-Cre配合scAAV-DIO實現更加精細、快速的細胞標記。

圖5 scAAV-FLEx-mRuby2熒光蛋白在HVC(X)細胞群中限制性表達

（Sánchez-Valpuesta M, et al.,PNAS, 2019）

5. 過表達

利用scAAV過表達目的基因可以實現改目的基因在體內快速表達的目的，但是值得注意的是，由于scAAV容量有限，為了保證出毒及感染效率，目的基因盡量選擇1kb以內。

圖6 scAAV9-GFP感染皮層，三天結果

小結

scAAV具有多種血清型、快速表達、穩定表達、免疫原性相對較低的特點，因此適用于多種應用場景。