土壤DNA提取的解決專家

簡介

土壤樣品含有大量的微生物，其中絕大部分的微生物都是無法直接培養進行繁殖和研究。從土壤樣品中提取DNA是研究土壤微生物最為有效的方法。目前從土壤樣品中提取微生物DNA的方法主要有直接法和間接法。直接法是指把土壤樣品放在裂解液中，經過有效的破壁方法使微生物的DNA全部釋放到裂解液中，然后再進行分離提取，如Zhou的方法。間接法是指將土壤放在一種的緩沖液中，如Buffer PBS等，把微生物從土壤中分離出來，然后再進行DNA的提取。間接法可大大降低土壤中腐殖酸，重金屬鹽對DNA提取帶來的影響，但是這種方法會丟失許多微生物，得到的DNA并非土壤樣品中的全基因組(宏基因組)，目前已經很少研究者會采用這種方法。從土壤樣品中直接提取DNA可最大可能性地獲得全基因組，但是這種方法卻面臨以下幾個問題：

1.???????? 腐殖酸的污染。土壤中，特別是森林，草地土壤含有非常豐富的腐殖酸。腐殖酸是一系列的有機物分子，部分分腐殖酸同核酸分子非常類似，在純化過程中非常難于去除。微量的腐殖酸污染都會導致下游應用，如PCR，酶切的失敗。

2.???????? 裂解方法。土壤樣品中含有各種微生物，如細菌和真菌等。革蘭氏陽性細菌和真菌都含有非常厚的細菌壁，讓這些微生物的細胞壁有效破裂是提取高產量宏基因組DNA的關鍵。由于土壤樣品的復雜性，使用酶法(如溶菌酶，破壁酶，蝸牛酶)或液氮研磨都不可行，因為土壤中含有各種金屬離子或抑制因子導致消化酶的活性失活，或土壤中的沙粒等會導致液氮研磨很難進行。

3.???????? DNA得率難于控制。土壤樣品或因肥沃，或因貧瘠，或因含水量豐富，或因干枯，或因取樣的深淺度，都會造成微生物數量和品種發生劇烈改變。在一個小范圍的土壤樣品DNA含量往往會差別成千上百倍。此外，某些土壤中含有的化學成分，如重金屬鹽，粘土物質都會造成DNA得率降低。

Omega Biotek公司的E.Z.N.A. Soil DNA Kit是目前土壤DNA提取最為優化的試劑盒。該試劑盒采用玻璃珠研磨法和熱激化學破壁法，可不需特殊的珠磨儀，在點動渦旋儀就可進行，適合于廣大的研究室。試劑盒中HTR Reagent是Omega Biotek公司獨家開發的腐殖酸吸附劑，能高效去除各種腐殖酸的污染。此外還采用無醇的硅膠柱純化方式，可高效去除土壤中各種可溶性金屬鹽，以及其它可溶性的抑制因子。該試劑盒已經成功地提取如下土壤(部分是客戶反饋)：自然保護區森林的土壤(長達30-40年森林土壤，表層有30-50cm落葉層)，紅樹林土壤，草地，耕地，海底泥，污泥，礦石區泥土，有機物污染的泥土，池塘泥，垃圾泥，空調管道堆積物等。

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實驗方法

為表明該試劑盒的優勢性，我們選擇以下不同組織樣品進行DNA提取實驗，每個樣品重復3次。

l????????? 森林類樣品：自然保護區森林土壤(廣東黑石頂自然保護區)和海南島紅樹林保護區

l????????? 礦石區樣品：礦石區水底土壤(濕)和礦石區地表土壤(干)

l????????? 耕地樣品：稻田土壤，菜地土壤

l????????? 有機物污染地表樣品：污水溝衍泥和生活垃圾堆放區

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操作方法（按Soil DNA Kit試劑盒進行）簡單描述以下：

1.???????? 取▲ 0.5g森林土壤/耕地土壤，或 ◆ 4g礦石區土壤和有機物污染土壤至15ml離心管中；

2.???????? 加入▲ 0.5g酸洗玻璃珠，或 ◆ 4g酸洗玻璃珠；

3.???????? 加入▲ 1ml Buffer SXL MLus，或 ◆ 8 ml Buffer SXL MLus；

4.???????? 立即在渦旋儀上最高速渦旋3分鐘。

5.???????? 加入▲100ul? ，或◆ 800ul Buffer DS，渦旋15s混勻

6.???????? 轉移至預熱至70^oC水浴鍋中，水浴10-15分鐘。

7.???????? 3000 x g離心3分鐘，轉移▲800ul，或◆ 7 ml 上清，并加入▲270ul Buffer SP2或◆ 2.3 ml Buffer SP2，渦旋混勻；

8.???????? ▲ 10,000 x g離心5分鐘，或 ◆ 5，000 x g離心10分鐘；

9.???????? 把上清液轉稱至新的2ml/15ml離心管中，加入0.7倍的異丙醇。(在處理礦石區樣品時和有機物污染的樣品中，還加入133ul糖原溶液)，渦旋混勻；

10.????? ▲ 10,000 x g離心5分鐘，或 ◆ 5，000 x g離心10分鐘沉淀收集DNA。

11.????? 倒棄上清液，并反扣于吸水紙上5分鐘；

12.????? 加入200 ul Elution Buffer，渦旋5秒。 65℃水浴20-60分鐘，讓DNA充分溶液。

13.????? 加入50ul HTR,反應2min后，離心，取上清。

14.????? 上清加入等體積（約200ul） XP2 Buffer，均勻后上柱。

15.????? 加入300ul XP2 Buffer，洗滌一次。

16.????? 加入700ul SPW Wash Buffer，洗滌兩次。

17.????? 空甩后，加入適當量的Elution Buffer洗脫即可。

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實驗結果

1.?????? DNA電泳結果

取10 ul 純化的基因組DNA上樣于0.8%瓊脂糖凝膠，80V電泳30分鐘，結果如下。

0.5g森林類土壤樣品

(前兩個自然保護區森林土壤，后兩個為紅樹林土壤)

0.5g耕地類土壤樣品

A: 水稻田土壤

B: 玉米土壤

4g 有機物污染土壤樣品

A: 生活垃圾堆放地

B: 污水溝底泥

4g 礦石泥

1和3是兩個礦石區水底土壤(濕)

2和4礦石區地表土壤(干)

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2.?????? DNA純度和產量分析