肝癌是全球癌癥相關死亡的第三大原因，肝細胞癌 (HCC) 是最常見的肝臟原發性惡性腫瘤。酪氨酸激酶抑制劑 (TKI) 治療療效仍然有限，免疫檢查點抑制劑 (ICIs)，如程序性細胞死亡蛋白-1 (PD-1) 阻斷抗體，顯示出比 TKI 更高的客觀反應率和更少的總體不良副作用。然而與黑色素瘤或淋巴瘤相比，HCC 的ICI 抗腫瘤活性僅達到中等的客觀反應率（15%–20%）。由于HCC腫瘤微環境 (TME) 是高度復雜的，具有組成各種功能單元、細胞鄰域 (CN) 的多種細胞成分。傳統的免疫組化或免疫熒光的方法難以滿足多參數檢測的需求，從而限制了其在復雜TME研究中的應用。成像質譜流式技術（Imaging Mass Cytometry，簡稱IMC），利用數十種稀有金屬標記抗體，對單個組織切片進行染色，可以同時檢測數十種蛋白質和蛋白質修飾，并保留細胞空間信息，確定空間分辨的單細胞表型，即能夠實現基于空間分辨率的 HCC TME 表型是TME 拓撲分析的實用工具。
近日，來自浙江大學梁廷波教授、盛劍鵬研究員帶領的研究團隊在HCC免疫治療領域獲得了突破進展。他們從大量亞細胞空間分辨率的蛋白數據中，首次揭示了 HCC TME 的各種拓撲功能單元，同時提供了最大的 HCC 病理景觀庫，突出了Kupffer 細胞特異性靶向而不是整體骨髓細胞阻斷作為 HCC 治療的新型免疫療法的潛力。研究結果發表在Gut（IF=23.06）期刊。
這項研究利用IMC量化了134名HCC 患者和7名健康供體的FFPE切片樣本中 36 個 marker 的表達和定位信息，獲得了562張亞細胞空間分辨率的高維腫瘤病理圖像。圖像中包含人肝臟微環境區域獨特的組織結構，以及主要基質細胞類型和免疫細胞群（Fig 1）。
Fig1．IMC獲得正常肝組織包含36個marker的表達代表性數據的高維圖像。(A)marker單色偽彩圖片，箭頭1: B細胞(CD3- CD20+)，箭頭2: CD8+ T細胞(CD3+ CD8+ CD4-)，箭頭3: 中性粒細胞(CD11b+ CD68- CD15+)，箭頭4：浸潤性巨噬細胞(CD11b+ CD68+ CD16- CD169low)，箭頭5: kuffer細胞(CD11blow CD68+ CD16+ CD169+)，箭頭6: 自然殺傷(NK)細胞(CD68-CD16+ CD57 +)；(B) 描繪肝臟組織結構，左圖Pan-keratin(青色)、αSMA(黃色)、collagen I (藍色)和CD31(紅色)，肝細胞呈青色，肝索、肝竇用白色虛線突出；右圖H&E染色，黑色虛線突出相同結構，比例尺100 μm。
如何將圖像信息解析出來并與臨床數據建立聯系，成了下—步研究的關鍵。研究人員對高維數據進行深入挖掘。
HCC微環境的組織拓撲分析
對于組織拓撲分析，研究人員首先利用CellProfiler軟件分割出組織圖像中的每個細胞，從而得到單細胞水平的marker表達數據。將分割數據輸入hisoCAT軟件進行tSNE和PhenoGraph和細胞鄰域（CN）等分析。將組織細胞劃分成了22 個元簇(metacluster)，包括3個肝細胞元簇、4個癌細胞元簇、2個內皮細胞元簇、2個成纖維細胞元簇和11個免疫細胞元簇。熱圖展示每個元簇中marker的表達，發現許多非免疫細胞表達PD-1，且去分化的肝細胞1和2表達的PD-1最高(Fig 2)。
Fig2. IMC數據處理和分析流程。圖像單細胞化后，根據單細胞表達數據聚成的22個元簇 (A) IMC數據采集示意圖，包括組織制備、抗體染色、圖像采集與組裝、單細胞識別、細胞降維、聚類和生存分析; (C)熱圖顯示元簇marker的平均表達，右側箱形圖顯示其在不同患者中的頻率分布模式。
HCC三種主要TME類型中免疫細胞和基質細胞特異性分布
分析了每個肝癌患者樣本中的多個區域，在HCC中發現了三種主要類型的TME(I-III型)，具有不同的基質和免疫細胞分布模式，這些模式對應于肝細胞去分化的不同階段。I型：肝細胞標記物, 如pan-keratin和E-cadherin強表達，肝臟的主要結構,包括肝竇和肝索保存完整，這表明I型區域類似于正常肝組織和癌旁組織；II型：成纖維細胞標記物，如αSMA和collagenI在區域高度富集，反映纖維化主要發生在該區域；III型：肝細胞失去了上皮標記物的表達，如pan-keratin和E-cadherin，提示肝細胞發生去分化，且增殖標記物Ki-67在III型區域表達水平高于其他區域(Fig 3A)。CD45+免疫細胞主要存在于I型和II型區域，而III型區域幾乎沒有這些細胞(Fig 3B)。這些結果揭示了三種主要類型TME和瘤內區域，表現出肝細胞去分化，間質細胞和免疫細胞的區域特異性分布。
Fig3.三種主要類型腫瘤內區域的IMC圖像。（A）E-cadherin (紅色),pan-keratin(青色)、Ki-67(綠色)和caspase-3(黃色) 的疊加圖片，用于識別HCC的I型、II型和III型區域。黃色和綠色箭頭分別表示Caspase-3和Ki-67染色。（B）αSMA(紅色)、collagen I (藍色)和CD45(綠色)的疊加圖觀察纖維化區域和免疫細胞分布模式。綠色箭頭表示免疫細胞。白色虛線突出纖維化區域。
單細胞分析不同TME中細胞的差異分布
作者進一步研究去分化過程與腫瘤微環境變化之間的關系，采用tSNE在單細胞水平上分析，并在tSNE圖中添加元簇(1-22)注釋(Fig 4A)。熱圖分析三種HCC TME中元簇頻率 (Fig 4B)。肝細胞、成纖維細胞、內皮細胞和不同的免疫細胞群分離成不同的元簇。根據pan-keratin和E-cadherin的表達減少，在I型區域有2個肝細胞元簇(1-2)。元簇1細胞顯示最強的pan-keratin和E-cadherin染色，而元簇2的肝細胞pan-keratin和E-cadherin表達減少，提示I型區去分化過程開始(Fig 4C)。II型區域的元簇3去分化肝細胞保持正常水平的pan-keratin，而E-cadherin表達有限(Fig 4D)。在III型區域有三群癌細胞(元簇4-6)，缺乏pan-keratin和E-cadherin染色，代表大部分去分化細胞 (Fig 4E)。因此，對高維IMC圖像的單細胞分析詳細地證實了細胞在I-III型區域的差異分布。
Fig 4. 不同區域的細胞組成和功能變化。(A)tSNE展示HCC TME的元簇組成；(B) 不同區域22個元簇頻率分布熱圖；(C-E)分別為I-III型區域tSNE圖
我們生活的城市由不同的社區組成(如工業、住宅或農業)，社區是城市特定功能發生的區域，如工業產出或能源消耗。在本研究中，TME相當于城市，而CN 相當于城市中的社區。作者將CN定義為中心細胞4 μm內的初級鄰近細胞及初級鄰近細胞的次級鄰近細胞(Fig 5A)。根據CN內的主要細胞簇對CNs進行注釋，分成了16個CN (Fig 5B)。為了確定CN功能單位是否與患者預后相關，作者對拓撲功能單元與患者總生存期(OS)和無進展生存期(PFS)之間關系進行探索。結合69例未接受新輔助治療或肝移植的患者的Kaplan-Meier生存分析，生成每個患者的拓撲圖，計算CN功能單位頻率。發現癌細胞富集的CN (CN9)與患者OS和PFS較差相關，CD8+ T細胞富集的CN (CN13)與患者OS延長有關。且KC-富集的CN、InfM-CN與患者預后呈相反關系。高頻率KC富集的CN (CN4)與患者OS和PFS較差相關，而InfM-CN (CN7)較高頻率與患者OS無顯著相關(Fig 5D)。這些結果表明，肝癌的拓撲功能單位可能成為新的肝癌患者預后生物標志物。此外, KC和InfM組成功能相反的CNs肝癌TME。KC-CN頻率高的患者預后較差，而infM-CN頻率高的患者預后較好。
Fig5.肝細胞癌腫瘤微環境細胞功能單位與患者預后的相關性。(A)CN分析方法；(B) 13種主要的CN類型首先通過CN內的主要細胞類型進行注釋，然后通過CN中每個細胞類型的縮放頻率(如圖y軸所示)進行聚類；(D)按照A所示的程序對患者的IMC圖像進行拓撲分析，然后計算每個患者的CN頻率。比較不同類型CN頻率的高或低與患者的總生存期和無進展生存期的關系。
肝癌微環境內細胞鄰域與患者生存的相關性
接下來作者構建小鼠模型，利用IMC等技術，證明了肝臟中Kupffer細胞的消耗在很大程度上增強了T細胞反應，減少了肝臟腫瘤的生長并且腫瘤對抗PD-1治療反應敏感。突出了Kupffer 細胞特異性靶向而不是整體骨髓細胞阻斷作為 HCC 治療的新型免疫療法的潛力。
這項研究成功地采用Fluidigm的組織成像質譜流式系統對肝細胞癌腫瘤免疫微環境進行深入的拓撲分析。與傳統的免疫組化或者免疫熒光不同，IMC采用金屬元素作為抗體的標簽，利用質譜系統進行信號的檢測。從原理上避免了熒光串色、組織背景等因素對結果的影響，可在一次掃描中同時檢測幾十種蛋白質，已成為腫瘤微環境拓撲分析的有效工具，是研究健康組織或病理組織的理想手段。
參考文獻：
1 Sheng, J.P., Zhang, J.L., Wang L. et al. "Topological analysis ofhepatocellular carcinoma tumour microenvironment based on imaging mass cytometryreveals cellular neighbourhood regulated reversely by macrophages withdifferent ontogeny." Gut. 12 July 2021, doi:10.1136/gutjnl-2021-324339.