研究背景
脊髓在中樞神經系統中負責大腦和機體各器官之間神經信號的傳導，而撞擊、跌落等因素引起的脊髓損傷（SCI）可導致器官功能失常、癱瘓甚至死亡，且伴隨大量生理性和心理性的并發癥。SCI病情復雜，預后較差，且臨床上缺乏有效的治療手段。在損傷后，SCI的病理進程可分為急性期和慢性期。其中，在急性期，脊髓損傷部位發生組織壞死、水腫、出血，并快速募集炎癥細胞，大量釋放炎癥因子和活性氧，造成惡劣的炎癥微環境，進而導致脊髓二次損傷，擴大損傷區域和加劇損傷程度。而在慢性期，激活的星形膠質細胞和小膠細胞等逐漸形成致密的膠質瘢痕，再加上人體神經有限的再生能力，脊髓神經無法再生和重塑，導致機體功能恢復不佳。因此，根據SCI在急性期和慢性期的不同特點，對其實行雙時期的調控具有重要意義。
2023年3月2日，浙江大學藥學院高建青教授團隊在Chemical Engineering Journal上發表題為ROS filter coating scaffold protects 3D mesenchymal stem cell spheroids for dual-phase treatment of spinal cord injury的研究。該研究構建了一種ROS濾網包裹的雙層凝膠體系攜載3D間充質干細胞球（RF-pGel-MS）用于SCI的雙時期調控，并在SCI大鼠模型上獲得較好的運動學和組織學恢復。
研究內容
1. RF-pGel-MS的構建和表征
為了構建RF-pGel-MS，本研究首先通過合成兩端連接ROS響應的苯硼酸基團的化合物TPA，并與聚乙烯醇（PVA）發生交聯即可得到具有ROS清除能力的ROS濾網，RF；將多孔GelMA溶液進行紫外交聯即可得到具有疏松多孔結構，并可攜載MSC細胞球（MS）的凝膠，pGel；通過低粘附培養法對MSC三維培養即可得到球狀的MS。最后，將MS通過共交聯的方式攜載入pGel中。RF包裹在pGel-MS的外圍即可得到最終的RF-pGel-MS。掃描電鏡顯示，RF呈現致密的凝膠網絡結構。內部的pGel則呈現疏松多孔的凝膠網絡結構，有利于細胞在里面的存活。而MS則呈現致密的球形結構，表面可見規則排列的MSC。
2. MS旁分泌效應和神經滋養能力考察
ELISA檢測細胞分泌水平以及PC12分化實驗表明，MS相比同等細胞數量的MSC，具備更強的旁分泌功能，可分泌更高水平的血管生長因子（VEGF）、神經生長因子（NGF）和膠質來源神經滋養因子（GDNF），且能更加顯著地促進PC12類神經細胞的分化和軸突的延伸。這得益于MS的三維空間結構，可更好地擬合MSC的體內狀態和活性。有趣的是，本研究發現不同尺寸的MS的旁分泌水平和神經滋養也存在一定的不同，相比之下，尺寸較小的MS2和MS3表現更佳。
3. RF-pGel-MS抗ROS能力考察
在體外實驗中，外層的RF可快速清除過氧化氫，并以ROS響應性的方式降解。RF不僅有效保護PC12細胞，降低其胞內ROS水平，還可保護內部攜載的MS免受過氧化損傷。通過完全切斷脊髓的方式成功在SD大鼠上建立SCI模型。通過局部埋置的方式將RF-pGel-MS植入到損傷處進行體內考察。在急性期，RF-pGel-MS可顯著降低脊髓組織中DNA和脂質過氧化產物4-HNE、8-OHdG的水平。另外，本研究采用慢病毒轉染的方式使MSC表達GFP，并將得到的GFP-MSC用于MS的體內示蹤。結果表明，MS在RF的保護下，在植入體內后第4天仍可保持完整的形態。
4. RF-pGel-MS長期療效考察
將RF-pGel-MS植入到SCI大鼠中，考察大鼠術后5周的功能學和組織學恢復。各組模型大鼠在術后第1周均有體重下降現象，但在后續總體保持平穩，說明植入的凝膠體系無明顯的毒性。BBB評分結果表明，各組大鼠在術后5周均有一定的恢復。而RF-pGel-MS可明顯改善SCI大鼠的后肢運動能力，該組大鼠可觀察到大幅的踝關節活動，偶見負重行走動作。在第5周，本研究在大鼠后肢植入電極，并使用金屬點對后肢各關節進行標記，在Vicon成像系統的幫助下可直觀地觀察到大鼠后肢運動過程中各關節高度和角度變化以及腿部肌肉肌電信號變化。結果表明，經RF-pGel-MS治療后，大鼠后肢運動具有更大幅度的關節角度和高度變化，肌電信號在頻率和幅度上也顯著提升。最后，組織學考察表明，RF-pGel-MS可促進神經的再生和神經纖維的延伸。
研究總結
1. 針對SCI急性期和慢性期不同特點和需求，構建了一種集ROS清除、干細胞療法為一體的雙層凝膠體系，RF-pGel-MS。
2. RF可快速清除ROS，降低組織的過氧化損傷和減緩二次損傷，并保護支架體系的MS，提高其植入后的生存率。
3. 具有3D結構的MS可擬合MSC的體內狀態，相比2D結構的MSC具有更強的旁分泌效應和神經滋養效果。
綜上所述，該雙層凝膠體系有望為SCI雙時期調控治療提供新的思路。
吉凱助力
本研究采用了吉凱基因公司GFP-轉染慢病毒產品用于MSC的熒光標記，助力高水平的科學研究。經過慢病毒轉染和嘌呤霉素篩選的GFP-MSC可持續擴增并穩定表達GFP熒光。
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作者簡介
本研究第一作者為浙江大學藥學院博士研究生曹堅和吳佳禾博士后，通訊作者為浙江大學藥學院高建青教授和天津醫科大學總醫院馮世慶教授。