回顧了一下以前被咨詢到的問題，發現被各位老師問到最多的一個就是載體帶什么熒光比較好，或者要不要帶熒光，熒光是不是一定要帶，該怎么帶，又該如何去選擇熒光。光是想想，就成了一個繁瑣又讓人頭大的問題，今天我們就來捋一捋，看如何在色彩斑斕的熒光中挑到屬于自己的那款。

圖1：市場上常用熒光蛋白展示^【1】

1.  什么熒光比較好？

回答這個問題，我們需要轉換一下角度，與其是選擇最hao的熒光，不如說是選擇合適自己實驗體系的熒光。舉個例子，在細胞感染病毒或者轉染質粒之后下一步要面對的就是細胞學實驗，在林林總總的細胞學實驗中，有這樣一類實驗叫做凋亡檢測，而檢測結果目前文章最首肯的是雙熒光檢測的結果，很不巧這里的FITC熒光信號，凋亡前期使用的是綠色熒光，后期使用的是紅色熒光。如果我們的細胞中攜帶紅色或者綠色熒光，那么對于我們凋亡檢測而言是會有具大的干擾。那我就不能帶熒光了嘛？也不是這樣，如果可以避開紅光，綠光或者其他波長相近的熒光蛋白，選擇其他波長差異較大的，也是可以使用的。

圖2：細胞凋亡檢測Annexin V-FITC/PI 染色結果^【2】

2.熒光是融合還是非融合，這兩者有什么差異？

對于這個問題，我們先討論一下兩者使用的場景，首先什么時候需要融合熒光？熒光的常規用途是什么呢，方便告知我們細胞中有沒有被載體成功轉染，畢竟只有成功轉染載體的細胞才有熒光嘛，展開一下，同樣的道理，如果蛋白上融合了熒光蛋白，那么是不是只有這個蛋白才會被熒光示蹤，蛋白在哪它在哪，兩者執子之手，與子共生，蛋白多熒光就亮，蛋白少熒光就暗淡。這里就是融合熒光蛋白的兩個主要作用，觀察蛋白定位以及對表達量做相對定量，如果做了調控，可以從熒光強度的相對變化判斷其趨勢。

圖3：線粒體定位信號偶聯GFP標記線粒體(吉凱載體)^【3】

那什么是非融合呢？就是各做各的，蛋白獨立表達，熒光蛋白歲月靜好，不會因為其中一者被影響連帶另一個也被影響，自然這種情況下就沒有辦法像融合熒光一樣看定位，看表達量變化趨勢。

圖4：攜帶熒光的慢病毒感染細胞觀察熒光效果(吉凱載體)

3.那些場景下使用哪些熒光蛋白？

1.轉染/感染后觀察熒光：常規選擇EGFP/mCherry這類熒光蛋白，但不絕對，需要結合后續的實驗選擇具體的熒光蛋白標簽。提供一個各類熒光蛋白以及波長的鏈接供各位老師細細挑選(https://doi.org/10.1002/0471143030.cb2105s36)或者聯系相關工作人員獲取文獻。

2.活體成像類實驗：常規選擇螢火蟲熒光素酶Fluc(Firefly luciferase)，通過和熒光素鈉鹽或者鉀鹽這類底物在ATP的供能下產生熒光，并不需要被激發，極大減少了背景底噪帶來的影響，同時因為較大的波長，被肌體吸收的情況較熒光蛋白好很多，提高成像的效果。

圖5：FLUC細胞注射后活體成像分析調控帶來的影響(吉凱慢病毒)^【4】

備選通常是海腎熒光素酶Rluc(Renilla Luciferase)，該酶可以氧化腔腸素產生能量并在此過程中產生熒光，和螢火蟲熒光素酶不同的是，該體系不需要ATP的參與，但是因為低于Fluc的波長，且相對靠近肌體的吸收波長，同時特異性要差一些，成像效果上不如Fluc。

圖6：伴隨小鼠生長腦中腫瘤海腎熒光信號值產生的變化^【5】

EGFP或者mcherry這樣的可以嗎？可以，當然也可以，但是只能做體表或者眼球這樣的淺層成像，我們一直強調肌體是可以吸收藍綠光波段的波長，很不湊巧EGFP是綠光，如果在體內，提別是深層臟器，損失就更大，所以深層臟器就不要使用這類熒光蛋白了。那有老師會說紅光呢？是個不錯的選擇，但是很多激發波長也是在紅綠波段，整體不是很好，不過iRFP713這類的紅外熒光蛋白倒是可以獲得豁免，他們的激發和發射光都是在紅外波段，做成像也是可以的。

圖7：不同IRFP蛋白動物成像強度比較^【6】

3.互作類實驗：在討論這個之前，我們先不討論用什么熒光合適，研究互作往往會用到很多實驗，其中用到熒光的實驗主要有兩類，雙分子熒光互補實驗(BIFC)或者能量共振轉移熒光實驗(FRET/BRET)，BIFC是將一個熒光蛋白分成兩部分，分別構建在需要研究的兩個蛋白上，當兩個蛋白結合時，分為兩半的熒光蛋白得以接近，并且形成一個整體被熒光激發釋放出熒光。

圖8：A1陰性對照組未觀察到熒光信號，陽性對照組可見強信號，與 pHA-Tf2b 和 pFlag-Tuba1α 質粒共轉染的細胞顯示熒光信號，這表明 TFIIB 和 α-微管蛋白直接相互作用^【7】

這種方式存在一些缺點，比如對于溫度比較敏感或者結合需要的時間比較長，并不能實時觀測結合情況。那么我們就把目光換到FRET上，相較于前者把一個蛋白分成兩個，這種則是使用兩種不同熒光的蛋白，分別構建至兩個需要研究的蛋白上，然后兩者會結合？不不不，這里用到的是另一個原理，在熒光蛋白距離足夠接近時，A熒光蛋白的發射光如果在B蛋白的吸收或者說激發波長內，則熒光不發射，而是通過共振的方式傳遞給B蛋白，這樣就可以通過熒光的變化判斷兩個蛋白之間有沒有結合。

圖9：通過活細胞中的敏化發射對FRET進行成像，用 GFP2 和 YFP （A^D） 或

GFP2^YFP 串聯構建體并在室溫下 16 小時成像^【8】

嗯，但是這個方法也不是十全十美的，也是有一些缺點的，比如細胞本身熒光底噪的問題，那解決方案是什么，回憶之前活體成像環節提到的熒光素酶，這類蛋白可以在不被激發的情況下通過酶促底物反應產生光，這個前提下以熒光素酶作為熒光供體，常規熒光蛋白作為受體，就可以通過熒光觀察是否有互作了。然而，雖然說這兩者都可以研究結合，但是只要距離夠近哪怕是不結合也是可以發出需要檢測的熒光的，所以一定記得需要設置對照組哦。

圖10：由REV磷酸化誘導的構象改變增加了Rluc8和Venus之間的距離，促進了BRET的增加^【9】

4.一些特殊實驗對于熒光蛋白的要求：沒錯，常規實驗就是對熒光蛋白類型的要求，對于本本身理化性質要求不大，但是一些特殊的實驗卻需要特別考慮這一些問題。比如在對缺氧環境下進行熒光標記，或者通過熒光強度反應缺氧條件下一些基因被調控的情況時，常規的EGFP就變的不是那么合適，因為在缺氧的情況下常規的綠色熒光蛋白成熟會被影響，導致無法正常發揮功能，那替換的熒光應該選什么呢，選擇UnaG，該蛋白也是綠色熒光，同時可以在低氧的情況下成熟發光，且穩定性也滿足實驗要求。

圖11：低氧誘導因子激活系統檢測示意圖^【10】

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參考文獻…

1. A guide to choosing fluorescent proteins

2.Detection of apoptosis induced by new type gosling viral enteritis virus in vitro through fluorescein annexin V-FITC/PI double labeling

3.Endophilin B2 promotes inner mitochondrial membrane degradation by forming heterodimers with Endophilin B1 during mitophagy

4. Noninvasive Visualization of MicroRNA-16 in the Chemoresistance of Gastric Cancer Using a Dual Reporter Gene Imaging System

5. In Vivo Testing of Renilla Luciferase Substrate Analogs in an Orthotopic Murine Model of Human Glioblastoma

6. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging

7. TFIIB Co-Localizes and Interacts with α-Tubulin during Oocyte Meiosis in the Mouse and Depletion of TFIIB Causes Arrest of Subsequent Embryo Development

8. Spectral imaging and linear un-mixing enables improved FRET efficiency with a novel GFP2–YFP FRET pair

9. REV, a BRET-based sensor of ERK activity

10. Hypoxic niches attract and sequester tumor-associated macrophages and cytotoxic T cells and reprogram them for immunosuppression