軸突再生可以在解剖學(xué)上完整的脊髓損傷（SCI）中誘導(dǎo)，但強(qiáng)大的功能恢復(fù)是難以捉摸的。恢復(fù)神經(jīng)功能是否需要將軸突從特定神經(jīng)亞群定向再生到其自然目標(biāo)區(qū)域尚不清楚。為了解決這個(gè)問題，瑞士聯(lián)邦理工學(xué)院（EPFL）生命科學(xué)院NeuroX研究所的研究者們應(yīng)用了投射特異性和單細(xì)胞核測序來識別在不完全SCI后恢復(fù)行走的神經(jīng)細(xì)胞亞群。結(jié)果表明，化學(xué)吸引和引導(dǎo)這些神經(jīng)元的橫貫軸突到其自然目標(biāo)區(qū)域?qū)е滦∈笤谕耆玈CI后行走的實(shí)質(zhì)性恢復(fù)。因此，重建關(guān)鍵神經(jīng)元的自然投射是旨在恢復(fù)失去的神經(jīng)功能的軸突再生策略的重要組成部分。研究成果以“Recovery of walking after paralysis by regenerating characterized neurons to their natural target region”為題，發(fā)表在Science（IF：56.9）上。
早在2018年，雖然研究團(tuán)隊(duì)親眼見證了神經(jīng)元的軸突從脊髓斷裂面的一側(cè)延伸到另一側(cè)，兩側(cè)神經(jīng)元成功建立了連接，甚至連神經(jīng)電信號都部分恢復(fù)了，但遺憾的是，癱瘓小鼠的運(yùn)動能力卻沒有絲毫改善。
于是，作者的研究團(tuán)隊(duì)臥薪嘗膽5年，在Science新作中證明：關(guān)鍵神經(jīng)元的篩選，可以逆轉(zhuǎn)完全性截癱。下面我們來欣賞一下這篇文獻(xiàn)。
01表征參與自然恢復(fù)的神經(jīng)元
腰椎脊髓中負(fù)責(zé)產(chǎn)生行走的神經(jīng)亞群。通過對脊髓的單側(cè)橫切（Brown-Séquard綜合癥），這些神經(jīng)元失去了來自大腦的重要上位神經(jīng)輸入，從而導(dǎo)致在受傷一側(cè)無法產(chǎn)生行走。然而，無論是人類還是動物模型，在這些損傷之后都能夠恢復(fù)雙側(cè)的行走能力。作者之前的研究表明，在這種情況下，位于胸椎脊髓的神經(jīng)元通過繞過橫切處的側(cè)面，傳遞上位神經(jīng)指令以恢復(fù)行走。即使是在時(shí)間和空間上分隔的、對立的一側(cè)橫切損傷中，中斷了大腦到腰椎脊髓的所有直接投射的情況下，這些神經(jīng)元仍然能夠傳遞足夠的上位神經(jīng)輸入，以恢復(fù)雙側(cè)行走。在胸椎脊髓中切除這些神經(jīng)元并不會在沒有損傷的情況下改變行走，但會消除在單側(cè)或雙側(cè)橫切損傷后觀察到的自然恢復(fù)行走的現(xiàn)象。因此，這項(xiàng)研究的目的是解剖在這種自然恢復(fù)中起作用的神經(jīng)亞群的分子和解剖學(xué)特性。
作者使用重組腺相關(guān)病毒2（rAAV2）注射具有增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）核膜蛋白KASH的編碼的病毒，將其注入未受傷的小鼠腰椎脊髓，以標(biāo)記具有直接投射到腰椎脊髓的神經(jīng)亞群。這種策略使得可以通過熒光激活的細(xì)胞核分選聯(lián)合單核RNA測序（snRNA-seq）來獲得與特定投射的神經(jīng)亞群的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特性。
snRNA-seq顯示 EGFP-ON神經(jīng)元主要位于胸椎神經(jīng)元中的一個(gè)腹側(cè)亞群（Hoxa7），這個(gè)亞群表達(dá)了標(biāo)記Vsx2和長距離投射神經(jīng)元的標(biāo)記Zfhx3。作者將這些神經(jīng)元命名為脊髓（SC）Vsx2::Hoxa7:Zfhx3→腰椎神經(jīng)元。通過對未受傷的小鼠和康復(fù)行走的小鼠的神經(jīng)核進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元在所有嵌套在康復(fù)行走小鼠胸椎部分的神經(jīng)亞群中表現(xiàn)出最明顯的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。這證明了該群體參與自然恢復(fù)過程。
02胸部中繼神經(jīng)元的連接體特征
作者使用了交叉遺傳學(xué)和在Vsx2-Cre小鼠中的病毒示蹤來比較Vsx2-ON神經(jīng)元的分布和連接組。研究發(fā)現(xiàn)，Vsx2-ON神經(jīng)元占據(jù)中胸脊髓神經(jīng)元的5.9%，對中胸脊髓Vsx2-ON神經(jīng)元的示蹤顯示了其在整個(gè)腰椎脊髓的密集投射。研究者探究了中胸脊髓Vsx2ON神經(jīng)元是否可以分成局部投射和長距離投射的亞群。在脊髓中，通過Zfhx3的表達(dá)可以區(qū)分具有局部和長距離投射的神經(jīng)元。通過在Vsx2-Cre小鼠的腰椎脊髓注入rAAV2-Ef1a-DIO-Flpo，然后注入AAV5-Con/Fon-EYFP（增強(qiáng)的黃色熒光蛋白）到中胸脊髓，作者成功標(biāo)記了只對腰椎脊髓進(jìn)行投射的Vsx2-ON神經(jīng)元。結(jié)果表明，Zfhx3和Vsx2僅在投射到這個(gè)區(qū)域的神經(jīng)元中共定位（SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar）。對Vsx2-ON神經(jīng)元的局部（Vsx2-ON，Zfhx3-OFF）與長距離投射（Vsx2-ON，Zfhx3-ON）的數(shù)量進(jìn)行量化顯示，這兩個(gè)亞群在中胸脊髓神經(jīng)元中分布近乎相等。
作者推斷，作為上位神經(jīng)命令的中繼，SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元還必須接收來自參與癱瘓后行走恢復(fù)的關(guān)鍵上位神經(jīng)元的直接投射。為了揭示這個(gè)連接組，作者在巨細(xì)胞核中注入AAV5-CMV-TurboRFP（CMV，巨細(xì)胞病毒；RFP，紅色熒光蛋白），因?yàn)榫藜?xì)胞核神經(jīng)元對于這種恢復(fù)至關(guān)重要，然后在腰椎脊髓注入rAAV2-hSyn-GFP，并標(biāo)記Vsx2和vGlut2突觸小體。結(jié)果顯示，位于中胸脊髓的SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→lumbar神經(jīng)元接收來自vGi的投射，并且在自然康復(fù)后這種投射模式得以保持。
03 SCI后，軸突再生到其自然目標(biāo)區(qū)域
通過用短距離或無定向再生填補(bǔ)損傷間隙不能簡單地實(shí)現(xiàn)完全SCI后的行走恢復(fù)，而其中一個(gè)關(guān)鍵的附加要求之一必須是將軸突推動到它們在腰椎脊髓的自然目標(biāo)區(qū)域。
研究者提出了這樣的觀點(diǎn)，即遠(yuǎn)距離軸突生長、成熟和突觸形成的相對緩慢時(shí)間過程可能需要比生物材料沉積提供的更持續(xù)和更高濃度的化學(xué)引導(dǎo)生長因子傳遞。用慢病毒介導(dǎo)的GDNF表達(dá)替代生物材料沉積使軸突能夠在遠(yuǎn)離的兩個(gè)腰椎區(qū)域內(nèi)進(jìn)行廣泛的再生，進(jìn)一步證明了適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)引導(dǎo)梯度可以引導(dǎo)有向的遠(yuǎn)距離軸突再生，類似于發(fā)育過程中的方式。
為了確定再生的軸突是否包括源自SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元的軸突，研究者將rAAV2-hSyn-KASH-EGFP注入到腰椎脊髓。這種策略在軸突已經(jīng)再生到達(dá)腰椎脊髓的神經(jīng)元中專門表達(dá)EGFP。位于損傷上方的EGFP-ON神經(jīng)元被分選出進(jìn)行snRNA-seq，所得的轉(zhuǎn)錄譜被整合到我們的胸椎脊髓的圖譜中。將EGFP-ON神經(jīng)元的分布與未受傷脊髓中神經(jīng)亞群的分布進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元是主要受病毒標(biāo)記的亞群，確認(rèn)了這一神經(jīng)亞群成功再生到其自然目標(biāo)區(qū)域。追溯示蹤結(jié)合Vsx2-ON和Chat-ON神經(jīng)元的免疫標(biāo)記證實(shí)了這些結(jié)果。
未受傷的小鼠表現(xiàn)出類似的投射模式，這表明再生的SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元可能本質(zhì)上改變與其自然目標(biāo)的適當(dāng)聯(lián)系。我們還詢問，在再生SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元到達(dá)腰椎脊髓后，是否可以在解剖學(xué)上全SCI下方檢測到脊柱上的命令。我們發(fā)現(xiàn)，vGi的微刺激在腿部肌肉中誘發(fā)了大運(yùn)動誘發(fā)電位，揭示了脊髓上中心已經(jīng)恢復(fù)了對腰椎脊髓的功能訪問。這些結(jié)果表明，SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元被設(shè)計(jì)為腰椎脊髓的自然目標(biāo)區(qū)域再生功能性軸突。
04 解剖學(xué)上完成 SCI 后行走的大幅恢復(fù)
再生策略化學(xué)吸引并引導(dǎo)了參與自然恢復(fù)的分子定義的神經(jīng)元亞群重新生長到腰椎脊髓的適當(dāng)目標(biāo)區(qū)域，我們預(yù)計(jì)這種策略可能會在完全癱瘓后恢復(fù)行走。因此，作者在行走期間對全身運(yùn)動學(xué)進(jìn)行了縱向量化。在所有小鼠中，再生策略促進(jìn)了從SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元到腰脊髓自然靶區(qū)的投影生長。這種再生與腿部運(yùn)動的逐漸恢復(fù)相吻合，在脊髓損傷后約3至4周。最終評估在8周內(nèi)進(jìn)行。治療組六只小鼠中有五只表現(xiàn)出類似于不完全 SCI 后小鼠量化的步態(tài)模式。這些結(jié)果表明，我們的再生策略導(dǎo)致了完全脊髓損傷后行走的實(shí)質(zhì)性恢復(fù)。作者不能排除這些相對不豐富的神經(jīng)元亞人群參與行走的恢復(fù)。因此，測試了SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元的必要性，其再生投影到腰脊髓的適當(dāng)目標(biāo)區(qū)域，以恢復(fù)后行走，因?yàn)橹档米⒁獾氖牵鼈儏⑴c了不完全 SCI后自然恢復(fù)。為此，我們首先通過在Vsx2-Cre小鼠的胸脊髓中表達(dá)白喉毒素接收（DTR）來消融這些神經(jīng)元。SCI八周后，接受我們策略的所有小鼠都恢復(fù)了步態(tài)模式的行走能力，類似于在不完全SCI后恢復(fù)行走的小鼠的步態(tài)模式。激活白喉毒素后，解剖學(xué)分析證實(shí)了胸脊髓中Vsx2-ON神經(jīng)元的幾乎完全消融。這些重組確定了胸腔Vsx2-ON神經(jīng)元在恢復(fù)后行走恢復(fù)中的作用。然而，他們沒有確定局部與投射Vsx2-ON神經(jīng)元各自的作用。作者在此測試了在完全 SCI 后行走恢復(fù)中從 SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰椎神經(jīng)元到腰椎脊髓的項(xiàng)目的必要性。設(shè)計(jì)了一種交叉化學(xué)遺傳策略，一旦小鼠表現(xiàn)出行走的實(shí)質(zhì)性恢復(fù)，我們就可以使再生的SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元靜音。我們將rAAV2-Ef1a-DIO-Flpo注入第四組的腰脊髓，然后將AAV5-Con/Fon-hM4Di-mCherry注入胸椎。這些小鼠都展示了行走的預(yù)期恢復(fù)。氯氮-氧化物（CNO）的給藥立即損害了所有測試小鼠的行走，導(dǎo)致步態(tài)模式類似于未經(jīng)歷再生的小鼠。相比之下，沒有接受AAV5-Con/Fon-hM4Di-mCherry輸注的小鼠沒有受到CNO給藥的影響。這些發(fā)現(xiàn)表明，從SCVsx2::Hoxa7::Zfhx3→腰神經(jīng)元到腰脊髓的自然目標(biāo)區(qū)域的再生投影有助于完全脊髓損傷后行走的實(shí)質(zhì)性恢復(fù)。
總 結(jié)
這篇文章探討了一種通過使特定的神經(jīng)元再生到其自然目標(biāo)區(qū)域來實(shí)現(xiàn)癱瘓后行走恢復(fù)的方法。研究的焦點(diǎn)是如何通過神經(jīng)再生的方式，將受損的神經(jīng)元重新連接到其原始的目標(biāo)區(qū)域，從而促使癱瘓患者重新恢復(fù)行走功能。這項(xiàng)研究提供了有關(guān)神經(jīng)再生對康復(fù)的潛在影響的見解，有望為治療和康復(fù)癱瘓患者的方法提供新的理論和臨床基礎(chǔ)。