說到基因編輯，大家可能立馬會想到crispr/cas9技術，原因不用多說，各種文章的發表已經讓crispr/cas9技術“無所不能”。 基因編輯技術的數量種類和實現的可行性方面都取得了巨大的進步，基因編輯技術的出現和不斷更新迭代使得研究復雜基因之間的相互作用成為可能，今天小編就如下基因編輯技術進行逐一介紹。

1、鋅指核酸酶

2、TALENs

3、Cre-Loxp

4、CRISPR

5、Sleeping Beauty transposon

鋅指核酸酶

鋅指核酸酶（ZFN）代表了邁向高效，有針對性的核酸酶的第一步。為了產生ZFN，設計了一系列鋅指與特定基因組基因座結合，然后與FokI核酸酶融合。識別兩個相鄰位點的配對ZFN切割DNA，從而啟動HDR。

最經典的鋅指核酸酶是將一個非特異性的核酸內切酶FokI與含有鋅指的結構域進行融合，其目的自然是對特定序列進行切割。鋅指識別三聯體，FokI核酸酶作為二聚體起作用，在兩個不同ZF目標位點之間的間隔區切開DNA。被切開的DNA可以由切除的修復機制使切開處的單鏈部分被刪除，然后又重新接到一起。

理論上講，我們可以利用這種方法完成對染色體上特定片段的刪除，從而達到構造突變體或完成治療的工作。但是ZFN的效用受到合成時間長和非模塊化組裝工藝的限制。盡管計算工具有助于改善設計，但無法為每個基因組基因座設計合適的ZFN對。

TALENs

TALENs在基因編輯技術上邁出了一大步。該模塊系統基于從Xanthomonas spp分離的TAL效應子DNA結合蛋白與FokI核酸內切酶融合。經驗豐富的科學家制作ZFN可能需要六個星期的時間，而TALENs技術的出現使得新手可以在短短幾天內完成TALEN的構建。

TAL中心靶向結構域由33-35個氨基酸重復序列組成。這些重復由兩個氨基酸組成，彼此不同，也就是它們的重復可變雙殘基（repeat-variable di-residue，RVD）。最終，正是這種RVD決定了TAL效應子（TALe）將識別出哪個單核苷酸：sHD靶向胞嘧啶，NI靶向腺嘌呤，NG靶向胸腺嘧啶和NN靶向鳥嘌呤。

由于ZF靶標僅限于由具有相應鋅指的三聯體組成的序列，因此平均每500bp基因組中有潛在的可靶向位點。TAL效應子有一些限制，例如目標必須以T開頭，但它們仍然具有大約每35bp就可以找到潛在目標位點。

Cre-Loxp

Cre-loxp是一個非常有趣的工具，該工具可用于在轉基因動物，胚胎干細胞和/或組織特異性細胞類型中創建特定的靶向DNA修飾?，F已廣泛用于控制基因表達，Cre重組酶在各種啟動子的控制下或以其可誘導的形式對基因表達進行復雜的時空控制，尤其是在轉基因小鼠研究中應用尤為廣泛。

Cre-loxp系統由源自P1噬菌體的兩個成分組成：Cre重組酶和loxP識別位點。

Cre重組酶最初命名是因為它“引起重組（ causes recombination）”，后來也稱之為“環化重組酶（cyclization recombinase）”），它是一個38 kDa的蛋白質，在loxP識別位點負責分子內和分子間的重組。該系統的主要優勢在于Cre的作用不依賴任何其他輔助蛋白或輔因子，因此可廣泛用于各種實驗中。

LoxP（(Locus of X(cross)-over in P1）則是位于P1噬菌體中的34bp序列，由兩個13bp的反向回文序列和8bp的中間間隔序列共同組成，核心序列的不對稱賦予了loxP位點具有方向性，典型的loxP序列為ATAACTTCGTATA-GCATACAT-TATACGAAGTTAT。loxP序列在除P1噬菌體之外的任何已知基因組中都不是天然存在的，并且由于足夠長，幾乎沒有機會隨機出現。因此，在DNA序列感興趣的位置插入loxP位點可以進行非常特殊的操作。

具體原理：

Cre重組酶介導兩個loxP位點之間的位點特異性重組事件，這些位點可以位于相同或不同的DNA片段上。單個loxP位點上的每個13 bp重復序列均被Cre蛋白識別并結合，形成二聚體。然后，兩個loxP位點以平行方向排列，從而允許四個Cre蛋白形成四聚體。雙鏈DNA斷裂發生在每個loxP位點的核心間隔區內，然后兩條鏈被連接，從而導致相互交換事件發生。根據loxP位點的位置和方向，以下三種情景：

?Inversion：當兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上但方向相反時，Cre重組酶能誘導兩個LoxP位點間的序列翻轉；

?Deletion：當兩個LoxP位點位于一條DNA鏈上且方向相同，Cre重組酶能有效地敲除兩個LoxP位點間的序列；

?Translocation：當兩個LoxP位點分別位于兩條不同的DNA鏈或染色體上，Cre重組酶能誘導兩條DNA鏈發生交換或染色體易位；

However，從以上情景我們也可以看到在Cre酶存在時，三種情景的變化其實是可逆的，那么該如何使這種動態變化達到一種穩定狀態呢？如下圖所示，通過引入兩對不同的LoxP位點，經過兩組LoxP點的兩輪重組我們即可達到一種穩定狀態。也就可以通過Cre的存在與否來控制基因的表達了。

具體原理如下：

圖中的白色箭頭對應的是LoxP位點，黑色箭頭對應的是Lox-2722位點。這兩種位點都能被CRE所識別，并在相同位點間發生重組，而不同位點之間不能發生重組。

發生重組時，方向相反的兩個位點之間的序列會被顛倒，而方向相同的兩個位點之間的序列被切除。

在圖中，假設第一次重組發生在LoxP位點之間，原本反向插入在啟動子后的目的基因（不表達），重組后變成順式結構，能夠被啟動子驅動表達。

第二次的重組發生在兩個Lox-2722位點之間，它們的重組導致了中間的LoxP位點丟失，同時只保留下一個Lox-2722位點。

最后剩下的Lox-2722和LoxP位點之間不能發生重組，所以整個基因結構便被固定下來。

在這個基礎上，也就產生了DO（Cre-off）、DIO（Cre-on）和Cre-Switch（Cre-off/on）。這三種系統中，LoxP序列在同一條載體上，并且方向相同， 只是外源基因的插入方向不同。

? DO系統（Cre-off）

插入基因與啟動子方向一致，在Cre重組酶存在的情況下會發生重組導致基因方向反向，因此基因不表達，所以稱之為Cre-Off；

? DIO系統（Cre-on）

插入基因方向與啟動子方向相反，在Cre重組酶不存在的情況下不表達，只有當Cre酶存在時，發生重組使基因方向與啟動子方向一致，才能使該基因表達，因此該系統稱之為Cre-On；

? FLEX系統（Cre-on）

FLEX系統與DIO系統一致，只是LoxP位點方向與DIO系統不同。插入基因方向與啟動子方向相反，在Cre重組酶不存在的情況下不表達，只有當Cre酶存在時，發生重組使基因方向與啟動子方向一致，才能使該基因表達。

? Cre-Switch系統（Cre-off/on）

對于Cre-Switch來講，則是在LoxP序列之間插入了兩個閱讀框，而這兩個閱讀框的方向相反，則可以通過Cre酶的存在與否來控制這兩個基因的表達。

Cre-loxp系統說到這里，說它是一個非常有趣的工具，大家都認同的吧？Cre-LoxP系統是在神經系統中應用最廣泛的條件性基因敲除工具，Cre-loxp系統優點如下：

? 高效性：Cre重組酶與具有LoxP位點的DNA片段形成復合物之后，可以提供足夠的能力引發之后的DNA重組過程，重組過程簡約高效；

? 特異性強：LoxP序列的唯一性，保證基因重組的特異性；

? 應用范圍廣：Cre重組酶可以在生物體不同的組織、不同的生理條件下發揮作用；

? 可由二型啟動子啟動表達：Cre重組酶的編碼基因可由任何一種二型啟動子驅動，由此保證Cre重組酶在生物體不同的細胞、組織、器官或者在不同的發育階段或不同的生理條件下表達，從而實現較高的組織和細胞特異性。

Cre/loxp系統是一種完善的研究工具，正由于Cre/loxp系統的上述優點，尤其是在轉基因小鼠領域。下面列出了一些最常見的用途：

? Cre依賴性基因表達：在目標基因上游放置兩邊都帶有loxP位點的終止密碼子（通常稱為“ lox-stop-lox”或“ LSL”表達盒），在沒有Cre重組酶的情況下，將阻止基因表達。在Cre存在的情況下，切除終止密碼子，基因表達。

? Cre依賴性基因敲除：將loxP位點置于基因的兩側（稱為“ floxing”，意為“flanked by loxP”），在Cre不存在時允許基因表達；當Cre存在時該基因表達將被破壞或刪除。

? 選擇標記的去除：在常規的小鼠編輯中，通常使用選擇標記進行目標克隆篩選，但是在初始選擇過之后，通常希望刪除標記。此時通過對選擇標記進行floxing處理，利用Cre可輕松執行此操作。

? 調節Cre表達：在發育的某些階段通過將Cre置于特異性啟動子下游，或通過將Cre置于誘導啟動子（例如強力霉素誘導表達系統），這樣Cre重組酶只能在指定的細胞中或指定的時間表達，同時結合上述一些loxP使用方法，可以進行不同要求基因修飾。

CRISPR

CRISPR是細菌免疫系統的重要組成部分，可使細菌記住并破壞噬菌體。在基因編輯應用中，Cas9核酸內切酶通過gRNA序列進行靶向，從而誘導雙鏈斷裂。像ZFN和TALENs一樣，CRISPR/Cas9也使用HDR，但是使用RNA來指定編輯使得該系統更便宜，更省時，更精確。與TALENs相比，CRISPR的應用更為廣泛，每周都會有使用該技術發表的新論文。

CRISPR/Cas9系統有兩個不同的組成部分：（1）指導RNA（gRNA）和（2）核酸內切酶，在上圖中為Cas9。當在細胞中表達時，gRNA/Cas9復合物通過gRNA之間的堿基配對募集到靶序列及其在基因組DNA中的互補序列。為了使Cas9成功結合到DNA，基因組DNA中的靶序列不僅必須與gRNA序列互補，而且還必須緊隨其后的是正確的PAM（protospacer adjacent motif）序列。請注意，PAM序列存在于DNA靶序列中，但不存在于gRNA序列中，任何具有正確靶序列且后接PAM序列的DNA序列都將被Cas9結合。不同的cas9蛋白識別的PAM序列不同。

CRISPR/Cas9技術存在如下應用：

1、導致雙鏈斷裂：完整功能的CRISPR/Cas酶將根據gRNA序列在特定位置引入雙鏈斷裂（DSB）。DSBs優先通過非同源末端連接（NHEJ）在細胞中修復，該機制經常會導致DNA中引物插入或缺失（indels）。插入缺失會導致移碼功能等位基因缺失。

2、導致單鏈斷裂：CRISPR/Cas切口酶突變體導致Grna靶向的DNA單鏈斷裂，而不是野生型Cas酶產生的雙鏈斷裂。使用切口酶突變體，需要兩個gRNA，兩個Grna位于DNA的兩條鏈，且兩個gRNA的位置距離合適。

3、堿基編輯：將dCas9與胞苷脫氨酶蛋白融合，可以成為一種特定的堿基編輯器，可以改變DNA堿基而不會引起DNA斷裂，該系統可以進行C-> T轉換（或相反鏈上的G-> A轉換）。

而2019年10月21日發表在Nature上面的文章"Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA”，已經實現堿基任意轉換與增刪。

4. 激活上調基因表達：將dCas9與轉錄激活肽融合可以增加特定基因的轉錄。合理設計gRNA序列以將dCas9激活子引導至感興趣的基因的啟動子或調控區域，實現基因的上調。

5、干擾下調基因表達：將dCas9與轉錄抑制肽（如KRAB）融合，可以通過干擾轉錄來降低基因表達。

Sleeping Beauty transposon

睡美人轉座子（Sleeping Beauty transposon）系統由兩個部分組成：1）SB轉座酶，催化轉座所需的酶； 和2）含有可在基因組內移位的基因表達盒的轉座子。睡美人轉座子被證明是無需使用病毒載體即可產生特定基因突變和基因破壞的令人興奮的工具。睡美人轉座子同樣可用于基因組編輯，可以作為CRISPR/Cas9技術的一種有價值的替代工具，并且睡美人轉座子的使用可能會在未來幾十年內有增長。

如上圖，（1）轉座子由位于質粒主鏈中目標基因（藍色）側翼的一組反向重復序列（綠色）組成。第二個質粒包含用于表達轉座酶的轉座酶基因（紅色）。

（2）轉座酶表達（紅色星號）并結合反向重復序列（綠色）；發生核酸內切酶反應，切割DNA。

（3）釋放的轉座子可以與帶有TA二核苷酸DNA鏈結合（在人類基因組中有許多這樣的位點）。除去轉座子后，原始質粒為空，然后質粒被細胞降解。

（4）轉座酶在DNA中產生雙鏈斷裂，并允許轉座子整合。

借助隨手可得的多種強大有效的基因編輯方法，我們已經進入了基因編輯的黃金時代。相信在以后會有越來越多的工作將注重于完善這些技術，以確保高特異性和高活性。

參考資料：

1. Genesis. 2000 Feb;26(2):99-109. Cre recombinase: the universal reagent for genome tailoring

2. Nature. 2019 Oct 21. doi: 10.1038/s41586-019-1711-4. Search-and-replace genome editing without double-strand breaks or donor DNA

3. Plasmids 101: A Desktop Resource Created and Compiled by Addgene March 2017 (3rd Edition)

4. CRISPR 101: A Desktop Resource Created and Compiled by Addgene May 2017 (2nd Edition)