Cy3酪胺（Cy3 tyramide），是一種用于熒光信號(hào)放大的探針，通過(guò)HRP和過(guò)氧化氫催化，標(biāo)記到抗體上。經(jīng)常有小伙伴問(wèn)小螢Cy3酪胺的實(shí)驗(yàn)方案，那么，教程來(lái)啦，小螢手把手教您做實(shí)驗(yàn)！
一.百螢 Cy3酪胺(Cy3 tyramite)適用范圍
Cy3 酪胺（Cy3 tyramide）是美國(guó)AAT Bioquest生產(chǎn)的Cy系列產(chǎn)品，該產(chǎn)品適合標(biāo)記抗體或蛋白,應(yīng)用于細(xì)胞或組織。
二.百螢 Cy3酪胺(Cy3 tyramite)優(yōu)勢(shì)
1.檢測(cè)靈敏度高；
2.熒光信號(hào)增強(qiáng)；
3.減少非特異性背景信號(hào)；
4.可以使用標(biāo)準(zhǔn)Cy3過(guò)濾器組輕松檢測(cè)。
三．百螢 Cy3酪胺(Cy3 tyramite)適用儀器
熒光顯微鏡
| Ex: | Cy3/TRITC濾波片 |
| Em: | Cy3/TRITC濾波片 |
| 推薦孔板： | 黑色透明底板 |
| 濾波片： | Cy3/TRITC濾波片 |
四．百螢 Cy3酪胺(Cy3 tyramite)實(shí)驗(yàn)方案
樣品染色示例
概述
1.固定/透化/阻斷細(xì)胞或組織
2.在封閉緩沖液中加入一抗
3.加入HRP標(biāo)記的二抗
4.準(zhǔn)備酪胺工作溶液，室溫下將其用于細(xì)胞或組織中5-10分鐘
溶液配置
儲(chǔ)備溶液配置
在沒(méi)有額外說(shuō)明的情況下，所有未使用的儲(chǔ)備溶液應(yīng)分成一次性等分試樣，并在制備后儲(chǔ)存在-20°C。 避免反復(fù)凍融
制備儲(chǔ)備溶液（1000x）
加入適量的DMSO，制成1-5mM的酪胺儲(chǔ)備液。
注意：未使用的Tyramide原液可以在2-8℃下儲(chǔ)存
工作溶液配置
酪胺工作溶液（1X）
將1μLTyramide原液加入1 mL含有0.003％H2O2的緩沖液中。
注意：1.Tris Buffer，pH = 7.4效果最佳。
2. Tyramide工作溶液即用即配。
實(shí)驗(yàn)方案
（本方案適用于細(xì)胞核組織染色）
細(xì)胞固定和透化
1. 在室溫下，用3.7％甲醛或低聚甲醛的PBS固定細(xì)胞或組織20分鐘。
2. 2.用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。
3.在室溫下，用0.1％Triton X-100溶液使細(xì)胞透化1-5分鐘。
4.用PBS沖洗細(xì)胞或組織兩次。
注意：組織固定，脫蠟和再水化，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)IHC方案對(duì)組織進(jìn)行脫蠟和脫水。根據(jù)需要，使用優(yōu)選的特定溶液/方案進(jìn)行抗原修復(fù)。
過(guò)氧化物酶標(biāo)記
1.可選：將細(xì)胞或組織樣本置于過(guò)氧化物酶淬滅液（如3%過(guò)氧化氫）中孵育10分鐘，以淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，然后在室溫下，用PBS沖洗兩次。
2.可選：如果使用HRP偶聯(lián)的鏈霉抗生物素蛋白，建議通過(guò)生物素阻斷緩沖液來(lái)阻斷內(nèi)源性生物素。
3.用封閉溶液（如含有1％BSA的PBS）在4℃下封閉30分鐘。
4.取出封閉溶液，加入稀釋好的一抗，在室溫下孵育60分鐘或在4°C下孵育過(guò)夜。
5.用PBS洗滌三次，每次5分鐘。
6.向每個(gè)樣品中加入100μL二抗-HRP工作溶液，在室溫下孵育60分鐘。
注意：孵育時(shí)間和濃度可根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度而變化。
7.用PBS洗滌三次，每次5分鐘。
酪胺標(biāo)記
1.準(zhǔn)備100μL 酪胺工作溶液，將其應(yīng)用于每個(gè)樣品，并在室溫下孵育5-10分鐘。
注意：如果您觀察到非特異性信號(hào)，可以縮短酪胺的孵育時(shí)間。 您應(yīng)使用不同孵育時(shí)間點(diǎn)的陽(yáng)性和陰性對(duì)照樣本，以優(yōu)化孵育期。 或者您可以在工作溶液中使用較低濃度的酪胺。
2.用PBS沖洗三次
復(fù)染和熒光成像
1.根據(jù)需要，對(duì)細(xì)胞或組織樣本復(fù)染。 AAT提供了一系列細(xì)胞核復(fù)染試劑，如表1所列。按照試劑說(shuō)明書進(jìn)行操作。
2.加上蓋玻片。
3.使用適當(dāng)?shù)臑V波器觀察酪胺標(biāo)記的信號(hào)。
表1.推薦用于核復(fù)染的產(chǎn)品
