Annexin V染色這個實驗，說難不難，說簡單也容易翻車。我之前就踩過不少坑——緩沖液配錯、貼壁細胞硬上流式、忘了加PI分不清早晚期……浪費了好多時間和樣本。
后來用了西安百螢生物這款AAT Bioquest品牌Annexin V-XFD594（熒光結構和Alexa Fluor 594完全一樣，但價格友好很多），慢慢把流程捋順了。下面這份操作筆記，全是實戰(zhàn)經(jīng)驗，希望能幫你少走彎路。
實驗前準備：這幾樣先備好
先說最重要的：結合緩沖液一定要自己配，別偷懶用PBS代替。配方給你們抄好了——10 mM HEPES、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl?，pH調 to 7.4。配好放4℃就行。
細胞每管準備1-5×10?個，懸浮細胞最好操作。強烈建議順手做一組陽性對照，我一般用星形孢菌素處理Jurkat細胞4-6小時，這樣至少知道試劑是work的。
染色步驟
- 收集細胞，離心，PBS洗一次——這步?jīng)]難度。
- 用200 μL結合緩沖液重懸細胞，一定要用結合緩沖液，別用PBS。
- 加2 μL Annexin V-XFD594偶聯(lián)物。想?yún)^(qū)分早晚期凋亡的，這時候順手把PI也加進去。
- 室溫避光放著，30-60分鐘。別超時，超過2小時背景會高。
- 直接上流式，或者拿去顯微鏡看。就這么簡單。
幾個關鍵提醒（容易翻車的地方）
孵育完1小時內趕緊上機，別拖著。不建議固定，固定之后背景會飄高，數(shù)據(jù)不好看。
流式的話用紅色通道，590 nm激發(fā)、618 nm發(fā)射，這個通道和PI可以一起用，補償調一下就行。
貼壁細胞比較麻煩，消化容易傷細胞。我的經(jīng)驗是直接上顯微鏡：在蓋玻片上養(yǎng)細胞、染色、洗兩遍，用2%甲醛固定一下，慢慢看。
結果怎么看
- Annexin V?/PI?：活細胞，啥事沒有。
- Annexin V?/PI?：早期凋亡，這就是你想抓的目標。
- Annexin V?/PI?：晚期凋亡或壞死，也算凋亡但分不清早晚。
這款Annexin V-XFD594我用下來，信號亮、背景干凈，關鍵是性價比真的高。如果你也在做凋亡檢測，不妨試試。
當然，再好的試劑也扛不住操作翻車。鈣離子、貼壁細胞、PI復染、分裝保存——這四點記住了，數(shù)據(jù)基本穩(wěn)了。
有什么問題歡迎隨時交流。
產品信息速查
貨號：20096
Ex/Em：590 / 618 nm（就是Alexa Fluor 594那個通道）
保存：-20℃避光，別反復凍融