編者按
肝細胞癌（HCC）已成為全球死亡率排名第三的腫瘤疾病，高通量測序顯示TERT啟動子、CTNNB1和TP53的突變是導致肝癌發生發展的主要原因。TERT啟動子和CTNNB1上的突變熱點賦予了顯性的功能增益(GOF)活性，而HCC中的TP53通常與并發的功能喪失(LOF)畸變、蛋白改變的錯義突變相關。研究表明p53突變體的腫瘤促進表型包括增強癌細胞的增殖和存活、上皮-間充質轉化、凋亡逃逸以及體內腫瘤的啟動能力，而其潛在的GOF機制可能是由于突變體干擾了其他蛋白質的結構改變或發揮了新的轉錄調控來激活下游致瘤途徑、劫持慢性免疫信號、促進染色質重塑和調節選擇性剪接事件。盡管TP53突變的發生被認為是HCC發展的早期事件，但直接研究p53 GOF突變在腫瘤早期作用的方法有限。
今天我們解讀一項于2022年10月發表在《Hepatology》的最新研究，該研究使用人類肝臟類器官來模擬人類肝癌發生的早期階段，從TP53丟失和L3環R249S突變位點引起病變。此外，HCC細胞系的染色質免疫沉淀測序對TP53缺乏導致腫瘤抑制功能喪失和突變p53獲得功能活性導致HCC的發生提供了重要的功能見解。
一、主要研究成果
1、ChIP-seq揭示了L3突變體在染色質重塑和應激反應中的GOF作用
為了系統地評估HCC中TP53錯義突變對轉錄激活的潛在影響，該研究對結合TP53及賴氨酸H3K27ac的全基因組進行了數據分析，并對4種TP53突變體（L3環及非L3環各兩個）進行ChIP-seq。結果表明這四種突變體與TP53突變位點無關，WT TP53的全基因組結合大部分都丟失了，這意味著在TP53錯義突變的腫瘤中，常規TP53轉錄活性的喪失很常見(圖1E)。值得注意的是，與WT TP53和其他兩個非L3環突變體相比，L3環突變體中只發現了一組TP53結合峰(圖1E)，意味著L3突變的獨家轉錄調控。而R249S突變體存在特有的啟動子-近端TP53結合峰，表明可能存在其他轉錄調控特性(圖1E)。
為了確定這些TP53突變體的功能本體，該研究對三組TP53結合峰（即WT TP53相關峰、L3環相關峰和TP53R249S/?顯性峰）進行了通路富集分析。結果顯示WT TP53主要參與調節細胞凋亡、細胞周期和DNA損傷，這支持了TP53在HCC中的抑瘤作用。而TP53突變體則表現出不同的調控活性，L3環突變體同與染色質重塑和生物合成過程相關的基因結合（圖1Gii），而TP53R249S/?則與應激反應和蛋白質修飾（圖1Giii）相關途徑有關。
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圖1
2、肝類器官中TP53KO和TP53R249S突變顯示致瘤性
為了了解TP53KO和TP53R249S在HCC中的癌癥啟動作用，該研究利用新鮮的非腫瘤肝組織構建了三例肝類器官并構建TP53WT、TP53KO以及TP53R249S模型（圖2A、2B）。Western Blot結果顯示TP53KO以及TP53R249S類器官中TP53蛋白的丟失和獲得（圖2Ci，Cii）；從形態學上看，TP53WT在單層隔間中保持了均勻性（圖2D），而TP53KO和TP53R249S類器官則出現了明顯的形態變化：增厚壁內陷進入管腔，多形性惡性特征，包括異型增生、高色、不典型和頻繁的有絲分裂、極性喪失和核細胞質比增加（圖2D）。與TP53WT類器官的導管結構相比，TP53蛋白缺失后形成了緊湊的類器官簇，R249S過表達的類器官在表面有大量的芽狀突起（圖2E），這與HCC類器官的生長模式非常相似。
值得注意的是所有TP53WT類器官在20代內都停止了生長（圖2G），而TP53KO和TP53R249S類器官在繁殖過程中繼續增殖和擴張，在超過50代中，每周的分裂率均為1：4（圖2G）。由此評估了肝癌干細胞標志物CD44和CD133在三種肝類器官中的表達，結果顯示與TP53WT相比，TP53KO和TP53R249S類器官中CD44和CD133的表達顯著增加（圖2H），表明癌癥相關的細胞干性受到顯著刺激。
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圖2
3、突變肝類器官TP53R249S位點誘發腫瘤模型
為進一步探究R249S突變和癌癥相關應激反應在肝癌發生發展中的作用，基因編輯構建TP53R249S類器官中R249S顯性靶點顯著上調（圖3A），同時TP53KO中LOF靶點顯著減少，這與原發性HCC中發現的表達一致。
通過雙熒光素酶實驗進一步確定了R249S突變體的直接轉錄效應：與對照組相比，在表達TP53R249S的細胞中，兩個與應激反應相關的R249S顯性靶點CLTC和PSMF1的啟動子活性明顯升高（圖3B）；同時與TP53R249S類器官相比，TP53KO類器官中存在大量緊湊的球狀體，而TP53 WT類器官中只有微小的零星球狀體（圖3C）。TP53缺失的異種移植模型（ODXs）顯示與TP53WT（0%）、TP53KO（17%）相比，TP53R249S（37%）的病變形成增加（圖3D）；組織學檢查顯示這些病變表現為腺狀形成的不典型細胞，核多形性高色，偶爾胞漿空泡化，核仁突出的惡性特征（圖3E）。
這些結果表明TP53R249S具有一定的致瘤潛能。更重要的是，突變體R249S直接轉錄激活PSMF1可以增加類器官對內質網應激的抗性，而下調PSMF1很容易消除這一點（圖3F-I）。
【3】
圖3
4、通過染色質重塑靶向TP53R249S的治療窗口
考慮到GO分析中R249S突變與“染色質重塑”密切相關，研究人員首先確認了TP53R249S肝類器官中R249S突變（BPTF、BRPF1和SMARCD2）顯著上調（圖4A）。體外模型中TP53R249S肝類器官更容易受到硫鳥嘌呤（一種抑制DNA合成和甲基化的表觀遺傳藥物）的影響，顯半抑制濃度值的敏感性顯著提高4.5-7倍（圖4B）。
接著，研究人員建立了TP53R249S肝類器官的ODX體內模型，一旦腫瘤體積達到約50 mm3，小鼠將連續14天隨機使用硫鳥嘌呤（1.5 mg/kg）。結果顯示，與對照組相比，TP53R249SODXs對硫鳥嘌呤更敏感，治療14天后腫瘤體積明顯縮?。▓D4C-D），而兩組治療組之間的體重沒有顯著差異（圖4E）；所有主要器官的組織學表現正常，表明硫鳥嘌呤的幾乎沒有副作用（圖4F）。這些結果表明硫鳥嘌呤在體外和體內均具有靶向TP53R249S相關的GOF脆弱性的HCC治療潛力。
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圖4
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