編者按
肝細(xì)胞癌（HCC）已成為全球死亡率排名第三的腫瘤疾病，高通量測(cè)序顯示TERT啟動(dòng)子、CTNNB1和TP53的突變是導(dǎo)致肝癌發(fā)生發(fā)展的主要原因。TERT啟動(dòng)子和CTNNB1上的突變熱點(diǎn)賦予了顯性的功能增益(GOF)活性，而HCC中的TP53通常與并發(fā)的功能喪失(LOF)畸變、蛋白改變的錯(cuò)義突變相關(guān)。研究表明p53突變體的腫瘤促進(jìn)表型包括增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖和存活、上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、凋亡逃逸以及體內(nèi)腫瘤的啟動(dòng)能力，而其潛在的GOF機(jī)制可能是由于突變體干擾了其他蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)改變或發(fā)揮了新的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來激活下游致瘤途徑、劫持慢性免疫信號(hào)、促進(jìn)染色質(zhì)重塑和調(diào)節(jié)選擇性剪接事件。盡管TP53突變的發(fā)生被認(rèn)為是HCC發(fā)展的早期事件，但直接研究p53 GOF突變?cè)谀[瘤早期作用的方法有限。
今天我們解讀一項(xiàng)于2022年10月發(fā)表在《Hepatology》的最新研究，該研究使用人類肝臟類器官來模擬人類肝癌發(fā)生的早期階段，從TP53丟失和L3環(huán)R249S突變位點(diǎn)引起病變。此外，HCC細(xì)胞系的染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序?qū)P53缺乏導(dǎo)致腫瘤抑制功能喪失和突變p53獲得功能活性導(dǎo)致HCC的發(fā)生提供了重要的功能見解。
一、主要研究成果
1、ChIP-seq揭示了L3突變體在染色質(zhì)重塑和應(yīng)激反應(yīng)中的GOF作用
為了系統(tǒng)地評(píng)估HCC中TP53錯(cuò)義突變對(duì)轉(zhuǎn)錄激活的潛在影響，該研究對(duì)結(jié)合TP53及賴氨酸H3K27ac的全基因組進(jìn)行了數(shù)據(jù)分析，并對(duì)4種TP53突變體（L3環(huán)及非L3環(huán)各兩個(gè)）進(jìn)行ChIP-seq。結(jié)果表明這四種突變體與TP53突變位點(diǎn)無關(guān)，WT TP53的全基因組結(jié)合大部分都丟失了，這意味著在TP53錯(cuò)義突變的腫瘤中，常規(guī)TP53轉(zhuǎn)錄活性的喪失很常見(圖1E)。值得注意的是，與WT TP53和其他兩個(gè)非L3環(huán)突變體相比，L3環(huán)突變體中只發(fā)現(xiàn)了一組TP53結(jié)合峰(圖1E)，意味著L3突變的獨(dú)家轉(zhuǎn)錄調(diào)控。而R249S突變體存在特有的啟動(dòng)子-近端TP53結(jié)合峰，表明可能存在其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控特性(圖1E)。
為了確定這些TP53突變體的功能本體，該研究對(duì)三組TP53結(jié)合峰（即WT TP53相關(guān)峰、L3環(huán)相關(guān)峰和TP53R249S/?顯性峰）進(jìn)行了通路富集分析。結(jié)果顯示W(wǎng)T TP53主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期和DNA損傷，這支持了TP53在HCC中的抑瘤作用。而TP53突變體則表現(xiàn)出不同的調(diào)控活性，L3環(huán)突變體同與染色質(zhì)重塑和生物合成過程相關(guān)的基因結(jié)合（圖1Gii），而TP53R249S/?則與應(yīng)激反應(yīng)和蛋白質(zhì)修飾（圖1Giii）相關(guān)途徑有關(guān)。
【1】
圖1
2、肝類器官中TP53KO和TP53R249S突變顯示致瘤性
為了了解TP53KO和TP53R249S在HCC中的癌癥啟動(dòng)作用，該研究利用新鮮的非腫瘤肝組織構(gòu)建了三例肝類器官并構(gòu)建TP53WT、TP53KO以及TP53R249S模型（圖2A、2B）。Western Blot結(jié)果顯示TP53KO以及TP53R249S類器官中TP53蛋白的丟失和獲得（圖2Ci，Cii）；從形態(tài)學(xué)上看，TP53WT在單層隔間中保持了均勻性（圖2D），而TP53KO和TP53R249S類器官則出現(xiàn)了明顯的形態(tài)變化：增厚壁內(nèi)陷進(jìn)入管腔，多形性惡性特征，包括異型增生、高色、不典型和頻繁的有絲分裂、極性喪失和核細(xì)胞質(zhì)比增加（圖2D）。與TP53WT類器官的導(dǎo)管結(jié)構(gòu)相比，TP53蛋白缺失后形成了緊湊的類器官簇，R249S過表達(dá)的類器官在表面有大量的芽狀突起（圖2E），這與HCC類器官的生長模式非常相似。
值得注意的是所有TP53WT類器官在20代內(nèi)都停止了生長（圖2G），而TP53KO和TP53R249S類器官在繁殖過程中繼續(xù)增殖和擴(kuò)張，在超過50代中，每周的分裂率均為1：4（圖2G）。由此評(píng)估了肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物CD44和CD133在三種肝類器官中的表達(dá)，結(jié)果顯示與TP53WT相比，TP53KO和TP53R249S類器官中CD44和CD133的表達(dá)顯著增加（圖2H），表明癌癥相關(guān)的細(xì)胞干性受到顯著刺激。
【2】
圖2
3、突變肝類器官TP53R249S位點(diǎn)誘發(fā)腫瘤模型
為進(jìn)一步探究R249S突變和癌癥相關(guān)應(yīng)激反應(yīng)在肝癌發(fā)生發(fā)展中的作用，基因編輯構(gòu)建TP53R249S類器官中R249S顯性靶點(diǎn)顯著上調(diào)（圖3A），同時(shí)TP53KO中LOF靶點(diǎn)顯著減少，這與原發(fā)性HCC中發(fā)現(xiàn)的表達(dá)一致。
通過雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步確定了R249S突變體的直接轉(zhuǎn)錄效應(yīng)：與對(duì)照組相比，在表達(dá)TP53R249S的細(xì)胞中，兩個(gè)與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的R249S顯性靶點(diǎn)CLTC和PSMF1的啟動(dòng)子活性明顯升高（圖3B）；同時(shí)與TP53R249S類器官相比，TP53KO類器官中存在大量緊湊的球狀體，而TP53 WT類器官中只有微小的零星球狀體（圖3C）。TP53缺失的異種移植模型（ODXs）顯示與TP53WT（0%）、TP53KO（17%）相比，TP53R249S（37%）的病變形成增加（圖3D）；組織學(xué)檢查顯示這些病變表現(xiàn)為腺狀形成的不典型細(xì)胞，核多形性高色，偶爾胞漿空泡化，核仁突出的惡性特征（圖3E）。
這些結(jié)果表明TP53R249S具有一定的致瘤潛能。更重要的是，突變體R249S直接轉(zhuǎn)錄激活PSMF1可以增加類器官對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的抗性，而下調(diào)PSMF1很容易消除這一點(diǎn)（圖3F-I）。
【3】
圖3
4、通過染色質(zhì)重塑靶向TP53R249S的治療窗口
考慮到GO分析中R249S突變與“染色質(zhì)重塑”密切相關(guān)，研究人員首先確認(rèn)了TP53R249S肝類器官中R249S突變（BPTF、BRPF1和SMARCD2）顯著上調(diào)（圖4A）。體外模型中TP53R249S肝類器官更容易受到硫鳥嘌呤（一種抑制DNA合成和甲基化的表觀遺傳藥物）的影響，顯半抑制濃度值的敏感性顯著提高4.5-7倍（圖4B）。
接著，研究人員建立了TP53R249S肝類器官的ODX體內(nèi)模型，一旦腫瘤體積達(dá)到約50 mm3，小鼠將連續(xù)14天隨機(jī)使用硫鳥嘌呤（1.5 mg/kg）。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TP53R249SODXs對(duì)硫鳥嘌呤更敏感，治療14天后腫瘤體積明顯縮小（圖4C-D），而兩組治療組之間的體重沒有顯著差異（圖4E）；所有主要器官的組織學(xué)表現(xiàn)正常，表明硫鳥嘌呤的幾乎沒有副作用（圖4F）。這些結(jié)果表明硫鳥嘌呤在體外和體內(nèi)均具有靶向TP53R249S相關(guān)的GOF脆弱性的HCC治療潛力。
【4】
圖4
作為斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動(dòng)物、人體”四位一體的綜合技術(shù)服務(wù)體系，開展科研服務(wù)CRO、智慧實(shí)驗(yàn)室建設(shè)和精準(zhǔn)醫(yī)療三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特類器官平臺(tái)已建立肝癌、胰腺癌、胃腸癌等多種腫瘤類器官模型，并推出免疫療法治療抗腫瘤藥物的敏感性檢測(cè)服務(wù)，歡迎來電垂詢！
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