本文將詳細闡述：如何從數據依賴型串聯質譜獲得的DDA數據的MS1 譜圖中提取時間-強度色譜峰來進行肽段定量。這里先從Skyline軟件的下載安裝開始，幫助您快速入門，迅速了解該軟件一些功能，為以后的深度學習打下一個基礎。

下載網址：

https://skyline.gs.washington.edu/labkey/project/home/software/Skyline/begin.view

網站界面如下圖，點擊紅色箭頭指示的鏈接下載即可。

下載后雙擊setup.exe可執行文件，根據提示逐步完成安裝。

雙擊安裝好的Skyline桌面圖標，運行后的界面如下。點擊“blank document”就可以開始Skyline參數配置及定量分析。

4.1 肽段設置（Peptides Settings）

4.1.1 創建背景蛋白庫（Background proteome）

點擊“Settings→Peptide Settings”進入“Digestion”選項卡。蛋白水解酶為胰蛋白酶，最大漏切數目一般為2。

在中構建背景蛋白庫，單擊下拉框選擇，進入編輯界面。在中為蛋白庫命名，如果是第一次創建背景蛋白庫，單擊設置背景蛋白庫的存儲路徑，如果已有現成的背景庫，點擊打開。此時按鈕由灰色轉變為激活狀態，單擊添加Fasta文件。最后單擊完成背景蛋白庫設置。

4.1.2 構建譜圖庫（Spectral Library）

蛋白庫生成主要用到*.group文件。單擊“Library”選項卡，如果已經有現存的譜圖庫，直接勾選即可，否則單擊進入譜圖庫構建界面。

在中為譜圖庫命名，在

中選擇譜圖庫的保存路徑。勾選“Keep redundant library”可選框，保留冗余庫，目的是讓庫中保留盡可能多的譜圖信息。填寫為0.95，即設定FDR為0.05。

單擊進入數據導入界面。單擊添加構建譜圖庫的文件（一般為某種搜索軟件搜索完DDA數據后的結果，這里使用的是Proteinpilot軟件搜索，所以建庫文件是.group），單擊”Finish”完成譜圖庫構建。此步驟一般需要幾分鐘，先生成與每個*.group對應的*.xml文件，再執行導入，由*xml文件構建譜圖庫。在中確保本次構建的譜圖庫被選中，且無其他不必要的庫。

4.1.3 修飾設置（Modifications）

點擊“Modifications”選項卡，在中選擇修飾類型，在沒有特殊要求的情況下僅勾選以下4種修飾：

Carbamidomethyl (C)

Oxidation (M)

Gln→pyro-Glu (N-term Q)

Acetyl (N-term)

其他設置保持默認。

若中沒有想要的修飾，點擊“Edit list->Add”構建修飾。填寫修飾名，指發生修飾的氨基酸，在氨基酸的C端 or N端發生修飾，是否是可變修飾，填寫修飾的化學式，可點擊旁邊小三角進行選擇。完成后點擊即可。

4.2 離子設置

點擊“Settings→Transition Settings”，進入“Prediction”選項卡。

前體離子質量下拉框選擇單一分子量“Monoisotopic”

子離子質量下拉框選擇單一分子量“Monoisotopic”

碰撞能量選擇“ABI TOF 5600”（根據所使用的質譜填寫）

去族電壓擇“None”

優化庫選擇“None”

補償電壓選擇“None”

點擊按照下圖設置：

點擊按照下圖設置：

點擊按照下圖設置：

點擊按照下圖設置：

4.3 定量分析

4.3.1 載入譜圖庫

點擊“View→Spectral Libraries”，進入譜圖瀏覽界面。

較之前的設置而言（4種），譜圖庫中一般會含有更豐富的修飾類型，所以會提示是否考慮這些修飾，無特殊需求不考慮。

這里展示的是譜圖庫中所有肽段的信息，勾選，關聯每一肽段屬于哪一個蛋白質，點擊，即可將譜圖庫中的肽段導入“Targets”一欄中。

完成后會提示與蛋白質匹配上的肽段數，未匹配上的肽段數以及被過濾掉的肽段數。

單擊“OK”跳出對話框如下，會提示總體的蛋白，肽段及離子數目。

在主界面中，左側顯示所要研究的目標肽段，右側顯示譜圖庫信息，若是空白則可點擊“View->Library Match”查看。

4.3.2載入DDA數據

點擊“File→Import→Result”，進入結果載入界面，選擇”Add single-injection replicates in files”，單擊“OK”，載入DDA模式下生成的.wiff文件。

完畢，會提示是否去除所有wiff文件名稱中開頭重復的部分。完成后主界面展示了Targets、各樣本DDA模式下母離子的XIC和Labrary Macth。

4.3.3 樣本名稱更改

點擊“Edit→Manage Result”，可用于樣品名稱更改，以便后期分析。

至此，DDA數據的輸入與分析暫時結束,記得點擊“File->Save”保存到.sky哦。

4.4 輸出定量結果

點擊“File→Export →Report”輸出定量結果。

可點擊“Edit-->Add”，新增一個結果輸出的樣式，添加想要輸出的對象。最后輸出肽段定量表（*.csv格式），作為后續分析的主要數據來源。

至此，使用Skyline處理DDA數據的流程就暫時告一段落，現在可以嘗試著去構建一個屬于自己的Skyline文檔了。