之前小編已經(jīng)分享了空間轉(zhuǎn)錄組中基于原位雜交和原位捕獲的技術(shù)文章，現(xiàn)在小編給大家分享一篇基于激光顯微切割技術(shù)的空間轉(zhuǎn)錄組文章。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)余梅團(tuán)隊(duì)在International Journal of Molecular Sciences上發(fā)表Integrating LCM-BasedSpatio-Temporal Transcriptomics Uncovers Conceptus and Endometrial LuminalEpithelium Communication that Coordinates the Conceptus Attachment in Pigs（IF: 4.56）一文，通過(guò)激光捕獲顯微切割（laser capturemicrodissection，LCM）技術(shù)和RNA-Seq，之后使用免疫組化定位關(guān)鍵蛋白，以低成本構(gòu)建了豬胎體著床的時(shí)空間轉(zhuǎn)錄圖譜，實(shí)現(xiàn)了解析豬受孕以及胚胎與子宮內(nèi)膜腔上皮通訊的研究。
母豬妊娠期為110天到120天，豬是一種多胎動(dòng)物，在技術(shù)上很難在胎體與其周圍子宮組織之間建立空間上的一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。然而胎體和胎體周圍的子宮內(nèi)膜腔上皮之間的同步通信對(duì)于著床很重要。激光捕獲顯微切割 (LCM) 可以從組織中捕獲特定的單個(gè)細(xì)胞或組織，同時(shí)保持結(jié)構(gòu)和空間信息。結(jié)合LCM和RNA-seq技術(shù)，作者在豬的兩個(gè)關(guān)鍵植入階段從完整的胎體—子宮內(nèi)膜界面捕獲了胎體及其周圍的子宮內(nèi)膜腔上皮，并構(gòu)建了胎體—子宮內(nèi)膜腔上皮界面的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組譜，保留了原生空間信息。然后，作者確定了連接胎體和子宮內(nèi)膜腔上皮的通訊通路，發(fā)現(xiàn)這些通路在胎體著床中具有重要作用。
1. 豬胎盤-子宮內(nèi)膜界面三個(gè)空間不同區(qū)室的轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征
作者對(duì)同一子宮橫截面中的三個(gè)空間不同的區(qū)室進(jìn)行激光捕獲顯微切割（圖 1）。在低溫下將片段切割成13μm厚的切片，經(jīng)過(guò)固定和脫水后進(jìn)行激光捕獲顯微切割。這三個(gè)區(qū)室包括 (1) 與胎體相連的子宮內(nèi)膜側(cè)的子宮內(nèi)膜腔上皮（命名為 LE-M），（2）與 LE-M 相鄰的胎體和（3）與胎體相對(duì)的反子宮內(nèi)膜側(cè)的子宮內(nèi)膜腔上皮（命名為作為L(zhǎng)E-AM）。將六種類型的樣本（每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3個(gè)區(qū)室）用于 bulk RNA 測(cè)序，共檢測(cè)到 15,062 個(gè)基因。其中有已報(bào)道在豬子宮內(nèi)膜腔上皮中表達(dá)的基因，例如SPP1（分泌磷蛋白 1）、MUC1（粘蛋白 1）和STC1 (Stanniocalcin 1) ，以及豬受孕表達(dá)基因，包括IFNG（干擾素 γ）、PLET1（胎盤表達(dá)轉(zhuǎn)錄本 1）、PLAC1（胎盤特異性 1）和PLAC8（胎盤特異性 8）。
圖1實(shí)驗(yàn)工作流程示意圖
分別從妊娠第12天（gd12，著床前階段）和第15天（gd15，著床階段）收集未沖洗出胎盤的豬子宮節(jié)段，并使用低溫恒溫器進(jìn)行橫切。對(duì)每個(gè)階段的胎盤-子宮內(nèi)膜界面的三個(gè)空間上不同的隔間進(jìn)行激光捕獲顯微解剖 (LCM)，并通過(guò)RNA-seq進(jìn)行分析以生成時(shí)空轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。LE-M：子宮內(nèi)膜側(cè)的子宮內(nèi)膜腔上皮；LE-AM：反子宮內(nèi)膜側(cè)的子宮內(nèi)膜腔上皮；C：胚胎。
2. 著床階段前和著床階段三個(gè)空間不同區(qū)室的時(shí)間轉(zhuǎn)錄變化
在著床之前和著床階段獲得的LE-M和LE-AM中分別檢測(cè)到1699和1607個(gè)基因差異表達(dá)。大多數(shù)差異表達(dá)基因（DEGs）在外泌體方面富集。在LE-M中鑒定的DEG中，與整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路相關(guān)的基因在著床階段上調(diào)。在LE-AM中鑒定的DEG中，參與碳酸脫水酶活性的基因上調(diào)，但與細(xì)胞表面相關(guān)的基因在著床階段下調(diào)。此外，作者在著床階段之前和著床階段在胚胎中識(shí)別了989個(gè)DEG，三個(gè)不同區(qū)域的轉(zhuǎn)錄調(diào)控在著床之前和著床階段明顯不同。
圖2豬gd12時(shí)LE-M和LE-AM之間鑒定的DEG熱圖和GO分析
( a ) 與gd12上的LE-AM 相比，LE-M 中識(shí)別的DEG的熱圖。（b）從妊娠第 12 天截取的整個(gè)豬子宮橫截面的示意圖。（c）與 gd12上的LE-AM相比，在LE-M中鑒定的上調(diào)DEG的GO分析。DEGs：差異表達(dá)基因；LE-M：系膜側(cè)的子宮內(nèi)膜腔上皮；LE-AM：抗中膜側(cè)的子宮內(nèi)膜腔上皮；gd12：妊娠第 12 天（著床前階段）。
3. 子宮內(nèi)兩個(gè)解剖位置上皮的空間轉(zhuǎn)錄差異
作者研究了胎體著床的子宮內(nèi)膜側(cè) (LE-M) 和胎體不著床的反子宮內(nèi)膜側(cè) (LE-AM) 之間的轉(zhuǎn)錄變化。總共鑒定了941個(gè)空間差異表達(dá)基因（DEG），其中在著床前階段檢測(cè)到345個(gè)，在著床階段檢測(cè)到596個(gè)。兩個(gè)階段LE-M中大部分上調(diào)基因主要富集在外泌體中（圖2和圖3）。此外，在著床階段之前和著床階段的 LE-M 中的大多數(shù)上調(diào)基因分別在頂端質(zhì)膜和炎癥反應(yīng)中顯著富集（圖2和圖3），而特定于上調(diào)基因的術(shù)語(yǔ)在著床階段的LE-AM主要與質(zhì)膜的組成部分有關(guān)（圖2和圖3）。因此，在著床階段，子宮內(nèi)膜腔上皮的分子特征因子宮內(nèi)的解剖位置而有很大差異。
圖 3豬gd15時(shí)LE-M和LE-AM之間鑒定的DEG的熱圖和GO分析。
(a)與gd15上的LE-AM相比，LE-M中識(shí)別的DEG的熱圖。（b）從妊娠第15天截取的整個(gè)豬子宮橫截面的示意圖。（c）與LE-AM（紅色）相比，LE-M中鑒定的上調(diào)DEG的GO分析，與LE-AM相比gd15上的LE-M（藍(lán)色）。DEGs：差異表達(dá)基因；gd15：妊娠第15天（著床階段）。
4. 在著床階段連接胚胎和子宮內(nèi)膜腔上皮的通迅途徑
分析揭示了來(lái)自胎體和子宮內(nèi)膜腔上皮的DEG參與的信號(hào)通路。這些通路大多與胎體附著有關(guān)，包括細(xì)胞外空間、SPP1介導(dǎo)的細(xì)胞粘附通路（如粘著斑和整合素介導(dǎo)的信號(hào)通路）和雌激素代謝和信號(hào)通路（如代謝通路和PI3K-Akt信號(hào)通路）。
5. 子宮內(nèi)LE中具有空間限制性表達(dá)模式的基因與胚胎著床之間的關(guān)聯(lián)
在著床階段LE-M和LE-AM之間鑒定的DEG中，SULT2A1（磺基轉(zhuǎn)移酶家族2A成員 1）和MEP1B（Meprin A 亞基β）是兩個(gè)最顯著差異表達(dá)的基因。SULT2A1在 LE-M中顯著高表達(dá)；相反，MEP1B在LE-AM中顯著高表達(dá)。因此，對(duì)以下時(shí)間的豬子宮橫斷面樣本進(jìn)行免疫組織化學(xué)和免疫熒光檢測(cè)：（1）發(fā)情后第12天和第15天，（2）妊娠后第12天和第15天。在發(fā)情后的第12天和第15天，子宮內(nèi)膜腔上皮中SULT2A1完全陰性，但含有分散的MEP1B陽(yáng)性信號(hào)。同樣，在妊娠第12天（著床前階段），子宮內(nèi)膜腔上皮對(duì)SULT2A1保持陰性，而對(duì) MEP1B 顯示分散的陽(yáng)性信號(hào)（圖 4）。然而，在妊娠第 15 天（著床期），在LE-M中大量檢測(cè)到SULT2A1，但在 LE-AM 中完全不存在；相反，MEP1B在LE-M中完全不存在，但在LE-AM中大量表達(dá)（圖 5）。
SPP1 是一種粘附分子，可以介導(dǎo)胎體與子宮內(nèi)膜腔上皮的附著。作者檢查了兩種類型的樣本在子宮橫截面中SPP1的表達(dá)模式（圖 5）。結(jié)果表明，無(wú)論胎體位于何處，僅在靠近胎體的子宮內(nèi)膜腔上皮中觀察到 SPP1（圖 5）。研究結(jié)果表明，在豬子宮的不同區(qū)域可能發(fā)生胎盤粘附。此外，分別在兩種樣品上研究了SULT2A1和MEP1B的表達(dá)模式。SULT2A1顯示出與SPP1完全相同的模式，無(wú)論胎體位于何處，SULT2A1都大量存在于靠近胎體的子宮內(nèi)膜腔上皮中，但在遠(yuǎn)離胎體的子宮內(nèi)膜腔上皮中完全不存在。因此，SULT2A1和MEP1B分別在兩個(gè)不同的胎兒著床和不著床的解剖子宮區(qū)域都有極高的表達(dá)。
圖 4.SULT2A1和MEP1B在豬子宮內(nèi)膜腔上皮中的空間表達(dá)模式。
( A ) SULT2A1 在豬的整個(gè)子宮橫截面中的免疫組織化學(xué)分析（n = 3 頭后備母豬/發(fā)情周期日或妊娠日）。( B ) 豬整個(gè)子宮橫截面中 MEP1B 的免疫熒光分析（n = 3 頭后備母豬/發(fā)情周期日或妊娠日）。在發(fā)情周期第 12 天（a、e）、發(fā)情后第 15 天（b、f）、妊娠第 12 天（c、g）和妊娠第 15 天（d , h )，分別。SULT2A1 定位于子宮 M 側(cè)和 AM 側(cè)的子宮內(nèi)膜區(qū)域的高倍放大圖像，分別取自發(fā)情周期第 12 天 ( a1 , a2 )、發(fā)情周期第 15天的相同子宮橫截面( b1 , b2 )、妊娠第 12 天 ( c1 , c2 ) 和妊娠第 15 天 ( d1 , d2 )。分別從子宮的 M 側(cè)和 AM 側(cè)顯示了MEP1B 在子宮內(nèi)膜區(qū)域的定位的更高放大倍數(shù)圖像，并且在發(fā)情周期第 12 天取自相同的子宮橫截面（e1, e2 )、發(fā)情周期第 15 天 ( f1 , f2 )、妊娠第 12 天 ( g1 , g2 ) 和妊娠第 15 天 ( h1 , h2 )。比例尺 = 50 μm。
圖 5 SPP1、SULT2A1 和 MEP1B 在兩種類型的豬子宮樣本中的子宮內(nèi)膜腔
上皮中的表達(dá)，根據(jù)妊娠第 15 天在子宮中的胎體定位定義。
（A）取自子宮橫截面的代表性圖像，其中胎體位于系膜側(cè)（n = 3 頭后備母豬）。（B，C）從子宮橫斷面拍攝的代表性圖像。（a - c) 蘇木精和伊紅染色的整個(gè)子宮橫截面。從相同的子宮橫截面拍攝更高放大倍數(shù)的圖像，顯示 3 種蛋白質(zhì)從 M 側(cè)定位于子宮內(nèi)膜區(qū)域（SPP1 為（ a11，b11，c11 ）；SULT2A1 為（ a21，b21，c21）；（a31 , b31 , c31 ) 對(duì)于 MEP1B)，在 M 和 AM 側(cè)之間 (( a12 , b12 , c12 ) 對(duì)于 SPP1; ( a22 , b22, c22 ) 對(duì)于 SULT2A1; ( a32 , b32 ,c32) 用于 MEP1B) 和 AM 側(cè) (( a13 , b13 , c13 ) 用于 SPP1；( a23 , b23 , c23 ) 用于SULT2A1；( a33 , b33 , c33 )用于 MEP1B)。LE：管腔上皮；M側(cè)：內(nèi)膜側(cè)；AM 側(cè)：反內(nèi)膜側(cè)。比例尺 = 50 μm。
胎體和胎體周圍的子宮內(nèi)膜腔上皮之間的同步通信對(duì)于胎體著床很重要。結(jié)合 LCM 和 RNA-seq 技術(shù)，作者在豬的著床兩個(gè)關(guān)鍵時(shí)間從完整的胎體與子宮內(nèi)膜界面捕獲了胎體及其周圍的子宮內(nèi)膜腔上皮，并構(gòu)建了胎體—子宮內(nèi)膜腔上皮界面的時(shí)空轉(zhuǎn)錄組譜，保留了原本空間信息。在著床前后以及三個(gè)空間區(qū)域都鑒定到大量表達(dá)差異基因，并通過(guò)免疫組化實(shí)驗(yàn)鑒定SULT2A1、MEP1B和SPP1基因空間表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了連接胎體和子宮內(nèi)膜腔上皮的通訊通路，以及這些通路在胎體著床時(shí)的重要作用。本研究成本較低，或許可以給研究者提供不同的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究思路。
Wang F, Zhao S,Deng D, Wang W, Xu X, Liu X, Zhao S, Yu M. Integrating LCM-BasedSpatio-Temporal Transcriptomics Uncovers Conceptus and Endometrial LuminalEpithelium Communication that Coordinates the Conceptus Attachment inPigs. International Journal of Molecular Sciences. 2021; 22(3):1248.