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小鼠初級運動皮層（Mouse primary motor cortex，MOp）是額葉的一部分，主要負責計劃、控制、運動執行，尤其是任何延遲反應有關的動作。在垂直方向上，皮層可以分為L1-L6六層，每層的形態和功能都有區別。大腦皮層的谷氨酸能神經元按其投射特性分為腦內(IT)神經元、大腦下投射神經元(或錐體束神經元)和皮質丘腦投射(CT)神經元；γ-氨基丁酸(Gaba)能神經元可以根據發育起源于內側神經節隆起和尾神經節隆起進行分類，并可以通過小白蛋白(Pvalb)、生長抑素(Sst)、血管活性腸肽(Vip)和Lamp5等標記基因進一步分類。單細胞轉錄組學研究揭示了大腦細胞的高度多樣性，并報道了在單個皮層區域中存在數十到上百種細胞類型。然而，想要了解不同類型細胞對大腦功能的作用仍然缺乏一個高分辨率、包含細胞空間組織和連接信息的細胞圖譜。莊小威團隊使用MERFISH（multiplexed error-robust fluorescence in situ hybridization，多路抗錯熒光原位雜交）來識別不同的細胞類型，并繪制它們在小鼠初級運動皮層(MOp)中的空間圖譜。通過整合MERFISH和神經逆行標記，進一步揭示了不同類型細胞的投射模式的復雜性。

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1.1 MERFISH成像及細胞聚類分析

作者選擇了258個標記基因進行MERFISH成像，其中包括已知的大腦皮層中主要神經元和非神經元細胞類型的典型標記基因，以及由單細胞和單核RNA測序聯合鑒定的神經元簇中差異基因表達以及互作分析選定的標記基因。MERFISH成像后將mRNA分配到單個細胞中，258個基因中有4個染色“不合格”，在隨后的分析中排除。從MERFISH中得到的單個細胞平均基因拷貝數在其他小鼠中可以重復，并且與混合RNA-seq測定的基因表達水平具有高度的相關性(圖1)。之后，通過無監督的聚類分析的MERFISH衍生的單細胞表達譜鑒定了39個興奮性神經元簇，42個抑制性神經元簇和14個非神經元簇(圖2)。

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a,單個視場的解碼MERFISH圖像，白線為識別的細胞。比例尺，20 μm（左）和 5 μm（右）。b，DAPI（左）和poly（A）RNA（右）圖像。

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圖2基于MERFISH的細胞類型分析，基于共同坐標框架的MERFISH圖像配準和細胞組成

a，樹狀圖顯示了MERFISH鑒定的39個谷氨酸能簇、42個gaba能簇和14個非神經元簇之間的層次關系。b，用UMAP細胞類型進行分類。c&d，MERFISH 確定的細胞亞類與scRNA-seq 和snRNA-seq數據集確定的細胞亞類之間的對應關系。e，MERFISH對不同細胞簇染色示意。f，整個成像區域以及初級運動皮質(MOp)中三個主要細胞類別。

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1.2細胞分布的空間差異

MERFISH 圖像直觀地顯示了在 MOp 及其鄰近區域細胞的轉錄差異(圖3 a)。谷氨酸能細胞簇，特別是IT亞類，在全部分層都有分布(圖3b)。與幾乎跨越整個皮層的IT細胞不同，ET、NP、CT和L6b細胞只分布在較深的分層(圖3 b，c)。個別的谷氨酸能細胞簇沿著皮層方向呈現出區分明顯的、部分重疊的分布，而且這些細胞簇許多呈現分布寬度小于個別皮層的厚度。Gaba能神經元也表現出高水平的空間多樣性，Lamp5、Sncg和Vip亞類在表層更多，而Sst和Pvalb亞類在深層更多(圖3b，d) 。值得注意的是，在亞群水平，大多數Gaba能亞群優先分布在一個或兩個皮質層(圖3d)。作者還繪制了非神經元細胞的空間組織(圖3b，e)。在三個星形膠質細胞群中，星形膠質細胞1分布于各層，星形膠質細胞2分布于L1和白質中，星形膠質細胞3幾乎只分布于白質中。少突膠質細胞譜系分為少突膠質前體細胞和3個成熟少突膠質細胞群，成熟少突膠質細胞在白質中富集，少突膠質前體細胞均勻分布于各層。血管軟腦膜細胞形成皮層的最外層細胞。其他類型的非神經細胞在皮質層和白質中的分布更為分散。

作者注意到不同細胞種群在空間上大量混合。為了量化每個細胞鄰近區域的細胞組成的復雜性，確定了每個細胞鄰近區域存在的不同細胞簇的數量，并觀察到高水平的局部細胞異質性，細胞鄰近區域的組成復雜性向深層遞增(圖3f)。

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a，冠狀切片中細胞群的空間圖?；贏llen圖譜確定的MOp區域是灰色的。b，相同切片的谷氨酸能(左)、