Click Chemistry on Peptide and Protein Modification

隨著蛋白質組學和生物醫藥等領域發展，多肽和蛋白質的修飾引起了人們的廣泛關注，成為當前一個非常重要的研究方向。通過對多肽和蛋白的修飾，可以研究蛋白質分子結構與功能之間的關系以及蛋白質-蛋白質相互作用，利用標記分子進行追蹤定位，另外還可以對一些活性多肽和蛋白質進行改性。

「點擊化學」（Click Chemistry）的核心是開辟一整套以含雜原子鏈接單元 C—X—C 為基礎的組合化學新方法，用少量簡單可靠和高選擇性的化學轉變來獲得更廣泛的分子多樣性，其模塊化、高效和多樣性以及高選擇性等特點，使之特別適合偶聯生物分子與人工配體，因為這類偶聯反應一般需要在非常溫和的條件（如生理學條件）下進行，如此一來便可保留多肽、蛋白質以及碳水化合物等生物分子的結構完整性以及基于這些結構的功能。而且點擊反應后生成的氮雜唑基團具有芳香環的穩定性，不易分解，可耐受強酸、強堿，并能在多種氧化還原條件下保持穩定。

因此點擊化學廣泛應用于多肽環化，DNA-多肽偶聯，熒光染料標記，分子表面固定等熱點領域。一個非常能闡述點擊化學上述優勢的例子是，Finn 和同事們 [1] 利用疊氮與炔基間的點擊反應對煙草花葉病毒的六十個位點進行羅丹明 B 標記，其標記效率達到 100%。

Figure 1. Scheme for peptides or proteins labeling via click chemistry

點擊化學在多肽合成中最早期的應用來自 Meldal 及其同事們的工作，他們將這類反應成功引入到多肽固相合成中 [2]，而類似地，Ghadiri 等則利用點擊反應來高效合成環狀多肽 [3]。

將多肽或蛋白與高分子進行偶聯的工作也不做少數，以期得到功能化的高分子材料或性能改善的生物分子。Lutz 課題組 [4] 將通過 ATRP 制備的結構確定的聚合物與 RGD(細胞黏附序列) 或 TAT(蛋白轉導結構域) 的短肽通過點擊環加成反應進行偶聯，實現了高分子材料的功能化。Schultz 等 [5] 在人超氧化物歧化酶 (SOD) 的氨基酸序列中的特殊位置上引入疊氮基團，隨后與炔基功能化的 PEG 聚合物骨架通過點擊化學結合，旨在提高其穩定性和溶解性，而所得到的 PEG 化的酶的活性與初始酶的活性相似，并未受到太大的影響。

糖蛋白在生物制藥領域有著非常重要的地位，但糖肽鍵對酶水解非常敏感，限制了其新陳代謝的穩定性，點擊化學能克服合成和新陳代謝的不穩定性。Danishefsky 及合作者 [6] 利用點擊化學將三個腫瘤相關的糖類抗原接枝到同一個多肽序列中。環十肽短桿菌酪肽 (tyrocidine) 是一種抗菌多肽，其抗菌機理是改變細胞質膜的通透性以破壞膜的雙層結構，使胞內物質外漏而致細胞死亡，對人和動物細胞膜起同樣作用，而通過在其上修飾上糖類分子顯著提高了其安全性能 [7]。

Figure 2. Tyrocidine and a triazole-containing glycosylated analogue.

值得一提的是，在蛋白質化學中蛋白質活性表達譜（Activity-Based Protein Profiling, ABPP）作為研究重要藥物靶點蛋白質的結構與功能的主要方法之一，是利用活性位點導向探針 (Active Site-Directed Probes) 對蛋白質的結構與功能進行研究的新型技術，以一種相對簡單明了的方法在分子、細胞水平研究活性小分子與生物大分子之間的復雜相互作用，從而從分子水平揭示生物體在生理或病理狀態下的關鍵調控機制。Cravatt 和合作者 [8] 通過點擊化學將活性位點導向探針連接到蛋白質中，實現實時在位觀察細胞環境中蛋白質活性的變化 [9]。

Figure 3. ABPP probes label active, but not inactive (e.g., inhibitor-bound, zymogen) enzymes in complex proteomes. Labeled enzymes are detected by in-gel fluorescence scanning and identified by affinity purification and MS analysis.[10]

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參考文獻：
1. Q. Wang, T. R. Chan, R. Hilgraf, V. V. Fokin, K. B. Sharpless, M. G. Finn. Bioconjugation by Copper(I)-Catalyzed Azide-Alkyne [3 + 2] Cycloaddition. J. Am. Chem. Soc., 2003, 125 (11): 3192-3193.
2. C. W. Torn?e, C. Christensen, M. Meldal. Peptidotriazoles on Solid Phase: [1,2,3]-Triazoles by Regiospecific Copper(I)-Catalyzed 1,3-Dipolar Cycloadditions of Terminal Alkynes to Azides. J. Org. Chem., 2002, 67 (9): 3057-3064.
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4. J. F. Lutz, H. G. B?rner, K. Weichenhan. Combining ATRP and 「Click」 Chemistry: a Promising Platform toward Functional Biocompatible Polymers and Polymer Bioconjugates. Macromolecules, 2006, 39 (19): 6376-6383.
5. A. Deiters, T. A. Cropp, D. Summerer, P. G. Schultz, et al. Site-Specific PEGylation of Proteins Containing Unnatural Amino Acids. Bioorg. Med. Chem. Lett., 2004, 14 (23): 5743-5745.
6. Q. Wan, J. Chen, S. J. Danishefsky. A Potentially Valuable Advance in the Synthesis of Carbohydrate- Based Anticancer Vaccines through Extended Cycloaddition Chemistry. J. Org. Chem., 2006, 71: 8244–8249.
7. H. Lin, C. T. Walsh. A Chemoenzymatic Approach to Glycopeptide Antibiotics. J. Am. Chem. Soc., 2004, 126 (43): 13998-14003.
8. A. E. Speers, G. C. Adam, B. F. Cravatt. Activity-Based Protein Profiling in Vivo Using a Copper(I)- Catalyzed Azide-Alkyne [3 + 2] Cycloaddition. J. Am. Chem. Soc., 2003, 125 (16): 4686-4687.
9. [a] B. F. Cravatt, E. J. Sorensen. Chemical Strategies for the Global Analysis of Protein Function. Curr. Opin. Chem. Biol., 2000, 4 (6): 663-668. [b] G. C. Adam, E. J. Sorensen, B. F. Cravatt. Chemical Strategies for Functional Proteomics. Mol. Cell. Proteomics, 2002, 1 (10): 781-790. [c] A. E. Speers, B. F. Cravatt. Profiling Enzyme Activities in Vivo Using Click Chemistry Methods. Chem. Biol., 2004, 11 (4): 535-546.
10. From: http://www.scripps.edu/chemphys/cravatt/research.html