針對骨骼系統的AAV靶向策略上期已經介紹了的血清型以及注射方式，這一期我們將繼續看看AAV在骨骼系統中的遞送。我們將結合一篇用到了吉凱產品的文獻[1]，看看在文章中，采用什么樣的AAV遞送方案對骨骼系統中進行研究。
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Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis
Runt相關轉錄因子-1（Runx1）是軟骨細胞與成骨細胞譜系結合所必需的，通過增強脊椎動物發育過程中的軟骨和成骨的生成。然而，Runx1在關節疾病中的潛在作用尚不清楚。在本研究中，旨在探討Runx1在前交叉韌帶置換術（ACLT）誘導的骨關節炎（OA）中的作用。結果發現軟骨細胞特異性Runx1基因敲除（Runx1f/fCol2a1-Cre）通過加速早期骨關節炎中蛋白多糖和II型膠原的損失而加劇軟骨破壞。此外，文獻還觀察到，在晚期骨關節炎中，生長板變薄和骨化，軟骨細胞增殖能力下降，生長板周圍骨基質丟失。并且通過腺相關病毒（AAV）在關節軟骨中過表達Runx1，并通過減緩早期骨關節炎軟骨中骨關節炎的破壞和減輕炎癥反應來確定其保護作用。
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結果1：Runx1基因敲除加重骨關節炎軟骨破壞
研究人員首先通過將Runx1f/f和Col2a1-CreERT雜交，得到Runx1f/+Col2a1-CreERT小鼠。為了探究Runx1在軟骨骨關節炎（OA）的病理過程，研究人員通過腹腔注射他莫昔芬在軟骨中實現了Runx1的敲除。收集膝關節的組織發現，Runx1在關節軟骨和生長板中的表達都顯著減少。并且進行體內成像發現，在Runx1CKO組中，觀察到關節變形以及組織碎片。通過HE染色以及Masson染色發現，Runx1 CKO組比WT組關節破壞更加嚴重，并且軟骨標志物膠原II（Col2a1）和SOX9的表達量低于WT組。這些結果都表明，Runx1基因敲除加速了全膝關節與關節軟骨的破壞。
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結果2：Runx1基因敲除對骨關節炎晚期生長板軟骨病理變化的影響
為了進一步研究Runx1在晚期中的效果，研究人員接下來分析了在前交叉韌帶置換術（ACLT）手術24周的股骨的生長板軟骨的病理變化。組織學結果表明在生長板軟骨以及軟骨細胞中增加的骨化基質傾向于直接暴露在髓腔中(圖2a)。μ-CT分析顯示生長板軟骨厚度顯著減少（圖2b）。相比較WT，敲除組的骨化區明顯丟失（圖2c）。定量的生長板厚度的分析（圖2d）和BV/TV（圖2e）證實了這些結果。IHC染色用于用PCNA檢測軟骨細胞的增殖能力（圖2f），顯示Runx1敲除OA組中數量增加的軟骨細胞失去了其增殖能力。然后，研究人員通過IHC測量Col2a1的表達（圖2g）和通過IF測量SOX9（圖2h），結果表明與野生型OA組相比，Runx1敲除OA組中Col2a1和SOX9的表達減少。這些結果表明，Runx1基因敲除影響OA晚期生長板軟骨的病理進展。
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結果三：Runx1過表達減緩骨關節炎軟骨破壞
接下來，研究人員在體內利用AAV建立了Runx1過表達模型：在ACLT手術恢復3-5天之后，將AAV-Runx1注射到關節腔內，通過體內成像（圖3a）顯示，AAV-Runx1過表達對軟骨的破壞有保護作用。根據HE染色以及Masson染色（圖3b）表明，相比較WT組，AAV-Runx1保留了關節軟骨的完整性。接著研究人員檢測了AAV-Runx1對COL2A1和SOX9表達的影響，結果表明相比較WT組AAV-Runx1組表達量相對較低(圖3d)，SOX9與它的趨勢相同（圖3e）。這些結果都表明，AAV-Runx1過表達減輕了OA的進展并且保護了膝關節的完整性。
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結果四：Runx1過表達減輕骨關節炎晚期生長板軟骨的病理進展
接下來研究人員檢測了Runx1過表達對骨關節炎癥晚期生長板病理進展的影響。通過HE、Masson染色表明，AAV-Runx1過表達保留了生長板軟骨的厚度（圖4b）,軟骨下部區域的小梁骨也被保留（圖4c）。盡管AAV-Runx1過表達的生長板寬度沒有達到WT組的寬度。通過IHC結果表明，COL2A1和SOX9的表達高于WT組（圖4g）。這些結果證明了，AAV-Runx1在OA病理進程中的作用。
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結果五：ChIP測序確定軟骨病理學中的新基因靶點
為了證實Runx1在軟骨病理中的機制，研究人員旨在識別直接結合轉錄因子Runx1的潛在的基因靶點。首先，用慢病毒在軟骨細胞中過表達Runx1，然后用CHIP拉下與此結合的所有DNA片段，結果表明16.22%出現在啟動子區域（圖5a）。然后通過KEGG通路分析發現富集在Hippo信號通路。然后研究人員通過GO分析出這些靶標的具體分布比例。分析出了五個新的靶點被認為是和軟骨相關的。這些靶點是跨膜前后轉化1（TAPT1）、蛋白質RIC1同源物（RIC1）、成纖維細胞生長因子20（FGF20），骨形態發生蛋白受體1B型（BMPR1B）和骨形態發生蛋白5（BMP5）。
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結果六：在軟骨病理學，新證實的和Runx1相互作用的致病因子
對這五個靶點進行進一步的實驗，研究人員通過CHIP-seq獲得基于靶標的19個基序。鑒定了兩個基序之后找到了與此作用的三個啟動子。為了進一步證明這三個靶標的基因表達，用siRunx1來檢查基因的變化（圖7a）。結果表明，TAPT1、RIC1和FGF20的基因表達水平在siRNA干擾后12小時降低。接下來，研究人員用慢病毒表達Runx1來檢測這些靶標的變化。IHC（圖7c-h）表明，蛋白質水平增加。在ACLT手術之后12周，結果表明TAPT1、RIC1和FGF20的基因和對照組一致。綜上可以看出，這些是Runx1的結合位點。
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總結：
在這篇文獻中，作者首先使用Col2a1-Cre 小鼠和SOX9-Cre小鼠雜交，獲得了Runx1敲除的小鼠，證明了Runx1在成年的骨關節炎小鼠中的作用。在AAV-Runx1過表達模型中，觀察到關節破壞、骨關節損傷以及生長板退化。Runx1作為一種多功能的轉錄因子，會涉及包括BMP信號在內的多種信號轉導途徑。在這篇文獻中，作者通過KEGG檢測了與Runx1相互作用的靶標富集分析，發現這些信號通路仍在軟骨細胞中發揮優勢?？傊?，這些結果都表明Runx1可能是一種針對OA和骨質疏松有效的治療靶點。
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吉凱助力：
在這篇文獻中使用了吉凱基因的Runx1的過表達AAV。在ACLT手術之后，AAV-Runx1被注射進膝關節，滴度為1E11vg/ml,5μl/關節。
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參考文獻：
1.????????? Zhou, C., et al., Runx1 protects against the pathological progression of osteoarthritis. Bone Research, 2021. 9(1).
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