蛋白質磷酸化是最重要的翻譯后修飾（PTM）之一，廣泛參與信號轉導、生長發育等幾乎所有生理過程中；此外大量研究證實，異常磷酸化修飾是引發動植物病變的重要原因，深入探究磷酸化變化對揭示生命活動、疾病發病機制等非常重要。 2019、2020年連續多篇蛋白基因組熱點研究的研究報道中，利用高通量蛋白組、磷酸化組技術，描繪大隊列組織樣本的蛋白質組表達和磷酸化蛋白質組表達變化，實現了疾病分型，進一步發現了精準治療新靶點。因此，大規模、大樣本的磷酸化修飾組學解決方案必將成為未來磷酸化研究的主要方向之一。 今天給大家帶來的研究成果是自中國臺灣中央研究院的陳玉如教授課題組優化的一種磷酸化高深度研究的新策略——基于DIA-MS構建的全局磷酸化蛋白質組學（Global Phosphoproteomics System，GPS）。采用此方法，人細胞樣本單次2h上機可檢測到36350個磷酸化位點，與傳統的耗時40天，采集270個數據，獲得38229個磷酸化位點的方法比，效率顯著提升。 主要結果 2. 基于GPS譜圖庫的DIA磷酸化定量準確性測試 為了評價新策略鑒定磷酸化位點定位和定量的準確性，作者合成了166條與肺癌信號通路相關的磷酸化肽段進行檢測分析。實驗表明，DIA策略構建的譜圖庫具有很高的質量，可實現位點的精確定位和準確定量。 3. 基于GPS譜圖庫的DIA磷酸化定量的重現性測試 接著，作者比較了常規DDA、分級的DDA、無需建庫的dirDIA和GPS-libDIA四種方法在磷酸化蛋白質組覆蓋率、CV% 和單針三重復DIA數據完整性三方面的差異。結果發現：（1）libDIA鑒定到的磷酸化位點數量接近DDA（RP），明顯優于DDA和dirDIA；（2）libDIA和dirDIA結果的定量CV值均小于DDA；（3）libDIA 和 dirDIA 的缺失值顯著少于DDA 。這些結果表明DIA的數據質量更佳，重現性更好，更適合大樣本量的蛋白組學分析。 圖3. DIA和DDA的比較 4. 應用1：用于肺癌細胞耐藥機制研究 應用全新的DIA 定量策略比較TKI 敏感的 PC9 細胞和耐TKI的CL68細胞在磷酸化水平上的差異，共6例樣本鑒定到30138個磷酸化位點。對其中16199個I類磷酸化位點，4122個磷酸化蛋白進行差異分析、皮爾遜相關性系數分析、KEGG分析、激酶分析、motif分析等，揭示了NSCLC的耐藥機制。 圖4. 肺癌細胞耐藥機制分析 5. 應用2：用于肺癌組織中深度磷酸化蛋白質組分析 應用全新的DIA 定量策略比較癌和癌旁組織在磷酸化水平上的差異，共10例樣本鑒定到32,407 個磷酸化位點。高深度的鑒定、全方位的分析，為潛在的藥物靶點提供了新的方向。
1. 基于DIA-MS構建全局磷酸化蛋白質組學流程
以非小細胞肺癌為例，作者使用多個NSCLC細胞系和癌組織，結合DDA和DIA兩方面的數據，構建全局性的混合磷酸化蛋白譜圖庫。該庫共包含了88107個磷酸化位點，對比單一樣本僅采用DDA方法建立的庫，數據量提升超過50%?；诖藥?，采用DIA采集模式，單個人細胞樣本可檢測到36350個磷酸化位點，可實現超高深度的檢測。
圖1. 混合譜圖庫的構建及磷酸化定量實驗流程
圖2. DIA策略的定性及定量準確性測試
圖5. 肺癌磷酸化蛋白質組分析
本文給大家介紹了磷酸化研究的新方法，該方法在檢測深度和檢測效率之間找到了平衡點，同時鑒定的結果中可量化可覆蓋的磷酸肽段范圍顯著增加。加上此方法具有較低的CV值和更高的可重復性，相信未來能夠極大助力磷酸化蛋白功能和機制的研究。
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