活體成像試劑之腔腸熒光素（Coelenterazine）

背?景：

活體成像技術（optical in vivo imaging）目前主要采用生物發光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術，生物發光法是基于熒光素酶能催化底物（D-Luciferin或Coelenterazine）化學發光的原理，將體外能穩定表達熒光素酶的細胞株植入動物體內，與后期注射入體內的底物發生反應，利用光學系統檢測光強度，間接反映出細胞數量的變化或細胞的定位。這項技術已被廣泛應用于多個領域，最常用的有腫瘤或疾病動物模型的建立，并可用于病毒學研究、siRNA研究、干細胞研究、蛋白質相互作用研究等。

原?理：

????常見的熒光素酶有兩種，分別是螢火蟲熒光素酶（firefly luciferase，編碼基因是luc）和海腎熒光素酶（Renilla luciferase，編碼基因是Rluc），前者的底物是D-Luciferin，后者的底物是Coelenterazine。它們共同的作用原理是在ATP和熒光素酶的催化作用下，底物被氧化發光（不同底物光的顏色和波長不同），當底物過量時，產生的光量子數與熒光素酶的濃度呈正相關性。?

Coelenterazine腔腸熒光素

美國YEASEN提供三種coelenterazine類似物，分別是Coelenterazine，Coelenterazineh，Coelenterazine 400a。雖然三種都可用于相同實驗，但是得到的結果有差異。

Coelenterazine：普遍認為是天然的腔腸熒光素，是海腎熒光素酶（Rluc）的作用底物，具有許多用途?？捎糜跈z測活細胞中鈣離子濃度，基因報告分析，BRET（生物發光共振能量轉移）研究，ELISA，HTS，組織或細胞中超氧陰離子和過亞**鹽的化學發光檢測。

Coelenterazine h:與Renilla熒光素酶或Gaussia熒光素酶使用具有一定的局限性。體外研究中比其他類似物更適合與鈣離子激活發光蛋白共用。據報道，Coelenterazine h的發光強度高于天然腔腸熒光素10-20倍，因此是用來檢測鈣離子濃度微小變化的有力工具。

Coelenterazine 400a:?是BRET研究中Rluc的首選底物，此腔腸素衍生物在390 nm和400nm之間發藍色光，對GFP acceptor的光發射干擾最小。

（1）Coelenterazine（天然腔腸熒光素）

分子式：C₂₆H₂₁N₃O_3?分子量: 423.48 g/mol?純度：95%?保存：-15°C避光，保存在惰性氣體下

Protocol：發光檢測實驗

1）使用管光度計室溫下定量檢測發光情況，每個樣品做三個平行；

2）加入底物10s內立即檢測，“integration time”為1 s；

3）對于細菌表達Gluc系統，甲醇溶解底物腔腸素制備10 mM儲存液，終濃度為10μmol/L。儲存液-20 °C保存，工作液制備過程需避光并置于冰上。?

（2）Coelenterazine 400 a/腔腸素400a

分子式：C₂₆H₂₁N₃O?分子量：: 391.48 g/mol?純度：95%

儲存液制備：

1）開封前將瓶子放到室溫溫育，以避免產品發生任何的冷凝；

2）用125 μL無水乙醇溶解50 μg Coelenterazine 400 a，最終濃度是0.4μg/μL.?，輕輕混勻；（注：避免用DMSO或其他溶劑來溶解腔腸素400a，因為試劑可能被氧化）

3）分裝后避光保存在-20°C，保持干燥；?

（3）Coelenterazine h/?腔腸素h（from Caliper LifeScience Inc.）

RediJectCoelenterazineh為即用的注射型生物發光底物，特別設計用于體內成像研究。通過最小化產品成分的變化，最小化凍融次數和嚴格控制不同批次的產品，使用Caliper公司的Coelenterazine h能確保客戶得到高重復性的結果。

優?點：

◆預制配方，不同批次間嚴格控制特別設計用于體內研究；

◆即用型產品通過最小化預成像準備步驟，減少時間和精力；

◆每瓶可用于5只動物的成像研究；（10?瓶/kit）

◆經IVIS成像系統驗證，控制體內成像質量；

顏色：黃色溶液（溶于丙二醇/檸檬酸鹽）

濃度：150 μg/mL?（10瓶無菌溶液，每瓶含1.2 mL濃度為150 μg/mL的Coelenterazine h?）

保存：?Store at ≤ -70 °C。

使用及注射劑量：

開始實驗前，37 °C水浴鍋解凍，避免重復凍融。靜脈注射(i.v.)或腹腔注射(i.p.)。

1.????????靜脈注射：推薦使用劑量15 μg/mouse(100 μL/mouse），用1 ml注射器直接從瓶內吸取溶液，然后用25 gauge或更高的針頭注射入小鼠體內。盡快成像檢測以獲得峰值信號。

2.????????腹腔注射：推薦劑量是30 μg/mouse (200 μL/mouse)，方法同上。

應用實例：

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產品報價：