超實用干貨—用嘌呤霉素篩個穩(wěn)轉細胞株
嘌呤霉素(Puromycin)是一種由白黑鏈霉菌產(chǎn)生的氨基苷類抗生素，是氨酰-tRNA分子3′末端的類似物，能夠與核糖體的A位點結合并摻入到延伸的肽鏈中，打亂核糖體上的肽轉運，造成翻譯過程中不成熟鏈終止，從而抑制蛋白質合成。
圖1嘌呤霉素結構式(CAS NO. 53-79-2)
嘌呤霉素產(chǎn)生菌Streptomyces alboniger內(nèi)發(fā)現(xiàn)的pac基因編碼嘌呤霉素N-乙酰轉移酶(pac)，賦予機體對嘌呤霉素產(chǎn)生抗性。這一特性如今普遍應用于篩選特定攜帶pac基因質粒的哺乳動物穩(wěn)定轉染細胞株。嘌呤霉素在細胞穩(wěn)轉株篩選中的普遍應用與慢病毒載體的特性有關，現(xiàn)在商業(yè)化的慢病毒載體多數(shù)都攜帶pac基因。在某些特定情況下，嘌呤霉素亦可以用來篩選轉化攜帶pac基因質粒的大腸桿菌菌株。嘌呤霉素作用迅速，在低濃度下即可快速導致細胞死亡。貼壁哺乳細胞對濃度為2-5 μg/ml的嘌呤霉素較為敏感，而懸浮細胞對濃度低至0.5-2 μg/mL的嘌呤霉素已經(jīng)很敏感。對嘌呤霉素穩(wěn)定耐藥的哺乳細胞可在一周內(nèi)生成。
穩(wěn)轉細胞株篩選
實驗原理：
通過將外源DNA/shRNA克隆到帶有pac基因的載體上，重組載體轉染至宿主細胞并整合到其染色體中，并隨細胞分裂穩(wěn)定傳遞，最后用嘌呤霉素進行篩選。
準備及預實驗：
1. 建議使用濃度
哺乳動物細胞：1-10 μg/mL，最佳濃度需要預實驗來確定。
大腸桿菌：LB瓊脂培養(yǎng)基篩選穩(wěn)定轉化pac基因的大腸桿菌，使用濃度為125 μg/mL。使用嘌呤霉素篩選大腸桿菌穩(wěn)轉株需要精確的pH值調節(jié)。
2. 溶解方法
用蒸餾水溶解嘌呤霉素配制成50 mg/mL的母液，0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝，于-20℃凍存。
3. 嘌呤霉素殺滅曲線的確定（以shRNA轉染或者慢病毒轉導為例）
嘌呤霉素有效篩選濃度跟細胞類型、生長狀態(tài)、細胞密度、細胞代謝情況及細胞所處細胞周期位置等有關，確定殺死未轉染細胞的最低濃度嘌呤霉素至關重要。初次做實驗一定要先進行Puromycin梯度篩選預實驗，建立殺死曲線（kill curve）。
1）以5~8×104 cells/孔的密度24孔板鋪板，培養(yǎng)過夜。
2）準備篩選培養(yǎng)基：含不同濃度嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基（如0-15 μg/mL，至少5個梯度）。
3）更換新鮮配制的篩選培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)，并觀察細胞生長情況，每2-3天更換新鮮篩選培養(yǎng)基。
4）每日觀察細胞存活情況，4-6天內(nèi)有效殺死所有非轉染細胞的藥物為最低濃度。
穩(wěn)轉株的篩選
慢病毒感染48-72h后（70-80%融合度），將細胞培養(yǎng)于含適當濃度Puromycin的培養(yǎng)液中，篩選至少48h。當對照未轉染的細胞加puro組全部死亡時，感染病毒組剩下全部是陽性細胞。
【注】：①當細胞處于分裂活躍期時，抗生素作用最明顯。細胞過于密集，抗生素產(chǎn)生的效力會明顯下降。細胞密度最好不超過25%。②每日觀察細胞生長狀態(tài)，嘌呤霉素的篩選至少需要48 h，有效濃度嘌呤霉素的篩選周期一般在3-10天。③病毒的MOI越高，每個細胞含有的shRNA拷貝和嘌呤霉素耐性基因越多。在做嘌呤霉素篩選時，越高MOI，含越多pac拷貝的細胞能耐受更高的嘌呤霉素濃度，調整嘌呤霉素的濃度去篩選轉染細胞，但是嘌呤霉素的濃度不能低于殺死曲線的最低有效濃度；
2）加入含有最低濃度的Puromycin培養(yǎng)基擴增細胞，待qPCR檢測結果合格后進行凍存。
翌圣生物推出兩種狀態(tài)的嘌呤霉素產(chǎn)品助力穩(wěn)轉細胞株篩選！
產(chǎn)品推薦
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產(chǎn)品名稱 |
產(chǎn)品貨號 |
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Puromycin (Solution 10 mg/mL) 嘌呤霉素鹽酸鹽溶液 |
60209ES |
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Puromycin Dihydrochloride 嘌呤霉素鹽酸鹽 |
60210ES |
客戶使用該產(chǎn)品發(fā)表的科研文獻（不完全統(tǒng)計：部分）
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