新鮮組織的OCT包埋
一、準備工作：干冰（粉末狀），OCT（冰上預冷30min以上）
1.?在包埋模具上做好方向標記，用于確定切片方向；
2.在包埋模具中加入1/3或者更多的OCT；
3.?修剪組織，去除組織表面血液或者組織液
4.將組織放入擠有OCT的包埋模具中，調整好位置
5.往包埋模具中繼續加入預冷的OCT，完全覆蓋組織
6.將包埋模具置于干冰上，蓋上干冰盒蓋子，或者微敞開放入-80冰箱速凍
7.待組織塊變白后，包埋完成，可以連同包埋模具一同保存運輸
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包埋流程
拍照記錄樣本信息
二、新鮮組織OCT包埋時注意事項
1.包埋時盡量排空氣泡，氣泡的產生會在OCT冷卻后在組織周圍形成空洞，致使切片時容易斷裂 ，影響切片效果, 成不了片；
2.對于需要觀察特定切面的組織（如血管橫截面等），可以在包埋時在組織底部墊襯與包埋盒底部面積等同的A4紙或濾紙，協助維持組織固定切面。必要時可以借助一些快干膠水做底部固定；
3.對于較小的需要同時幾個組織包進一個包埋塊時（如類器官等組織），也可以在底部墊襯濾紙或者A4紙，使組織盡可能在同一平面上。
?OCT組織送樣
·?新鮮組織取下后建議立即包埋，不建議放在組織保護液里寄送，有降解風險；
·?我們會提前給老師寄一些包埋盒和鋁箔紙袋，包埋后的組織密封在袋子里，隔絕外部空氣和水分，保存會更好；
·?包埋后的組織放在鋁箔紙袋里在-80°C放置一天后再干冰寄送，保證組織的凝固效果同時防止RNA降解；
·?若模型樣本老師無法自己取材，可以寄送活體小鼠到公司，由動物平臺取材，單細胞平臺協助進行OCT包埋。需要支付動物取材及尸體處理等費用，同時需要給到取材的protocal,以及在送樣前對包埋的具體位置提出明確需求。
石蠟組織送樣
·?石蠟樣本保守需要切30-40片，按照一張切片5um的厚度，石蠟塊包含組織的厚度至少0.2mm；
·?石蠟樣本需在切片前確認切片方向，樣本放到石蠟切片機上后無法再次調整方向;
·?石蠟樣本采用統一的透化條件，不需要透化預實驗，但需要進行粘附性預實驗，如果有多個石蠟樣本，每一個都需要做粘附性預實驗。
空轉選片
·?樣本收到后10個工作日內我們會給到切片、HE染色以及RNA質檢結果；
·?若樣本質檢合格（OCT：RIN≥7；FFPE: DV200>50%)，?? 且HE染色形態相對完整，OCT樣本需要老師在給到的TTK格式的圖片（使用對應軟件打開）中選定6.5*6.5mm2的目標區域進行標記，以便安排透化實驗；
·?正式實驗需要再次選片，需要提前跟老師約好選片時間；
·?空轉不能使用免疫熒光的樣本，我們可以給老師做免疫熒光的染色來確定位置，OCT包埋好的組織塊，切下來的切片先嘗試做免疫熒光，并結合HE染色的結構區域，一起摸索可用的區域在哪里，之后緊接著重新切片做HE染色和透化等空轉后續實驗；
·?如果老師有免疫熒光或者免疫組化的需求，或者需要切出多余的白片寄回給老師，均需要在售前充分溝通，比如需要的白片厚度、需要觀察的目的區域結構等，技術平臺也會根據經驗給出對應的建議。如果老師給到現成的抗體最佳孵育濃度和時間，我們可以使用老師現有參數，給客觀結果，否則還需要摸索免疫熒光的條件。
特殊樣本空轉注意事項
一、骨組織
- 骨組織空轉一般質檢都比較難通過，特別是對于骨齡比較大的樣本；
- 即便質檢通過，后面切片也不好切，很容易切碎；
- 骨組織貼片的時候也比較容易脫片；
- 對于石蠟骨組織，樣本本身可能細胞也比較少，空轉捕獲到的spot數可能偏少；
- 骨組織石蠟樣本除了容易脫片，且因為不確定透化即RNA釋放的效果，不能保證探針對RNA的捕獲效率，進而導致最后測到的基因數進一步減少。
二、皮膚組織
- 皮膚組織切片不好切且透化困難；
- 皮膚樣本因為分層，切片的時候如果縱切，各層暴露的面積太小，如果橫切，則很難切除一平層，這個風險需要老師知曉；
- 如果透化過度，細胞內釋放的RNA會彌散，進入附近組織區域，比如說老師這個皮膚組織，可能原本應該是真皮層細胞表達的基因，最后檢測分析在皮膚的表皮層的角質層有表達，那就沒辦法解釋；
- OCT包埋以后本身組織就是一團了，切的時候就算客戶標記好方向，但因為皮膚層的特殊性，也很難完全正好一類細胞橫切一層；
- 如果最后透化失敗無法繼續向下進行實驗，老師也要承擔前序包括HE染色、切片、RNA質檢、透化等費用。
三、血管組織
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- 人的血管樣本通常有疾病模型，雜質較多，質檢不容易通過；
- 血管如果剪開了平切，容易只切到某一種細胞層；
- （內膜/中膜/外膜），不能包含所有細胞類型；如果縱切；
- 由于血管壁的中空結構，包埋時容易產生空泡；
- 小鼠血管較軟，相對不容易包埋，對包埋技術要求較高；
- 基于血管壁的厚度（人動脈直徑2.8～3.0cm,厚度約1mm;
- 小鼠動脈直徑0.8mm,厚度約0.06mm)，取橫截面貼片；
- 血管中間的部分是空白的，只要周圍一圈血管壁才能覆蓋芯片；
- 對空轉芯片捕獲區域的利用率相對較低。
四、脊髓/骨髓組織
- 脊髓一般分離出來是半固態，長條狀，如果要做空轉，OCT包埋時候需要老師將脊髓平鋪包埋并標記號方向，這個有一定難度；
- 我們質檢一般切片厚度10um, 脊髓很薄，不好確定脊髓橫切面，有找不到老師要的病理區域的風險，可能切不了幾刀就切穿了；
- 骨髓也比較軟，不太好包埋，可能組織會變形；
- 切片的時候，骨髓容易切碎（連帶著骨頭一起碎掉，破壞骨髓的組織形態）。
五、角膜組織
- 需要確定橫切還是縱切面，空轉一個spot 55μm，點與點之間相距100μm,如果連2個點都覆蓋不到，那肯定需要橫切；
- 橫切的話需要保證在一個平面，如果老師角膜有弧度，包埋需要盡量保證在一個平面；
- 一般小的組織做空轉都需要考慮樣本的厚度和面積，老師不確定的可以做預實驗。