新鮮組織的OCT包埋
一、準(zhǔn)備工作：干冰（粉末狀），OCT（冰上預(yù)冷30min以上）
1.?在包埋模具上做好方向標(biāo)記，用于確定切片方向；
2.在包埋模具中加入1/3或者更多的OCT；
3.?修剪組織，去除組織表面血液或者組織液
4.將組織放入擠有OCT的包埋模具中，調(diào)整好位置
5.往包埋模具中繼續(xù)加入預(yù)冷的OCT，完全覆蓋組織
6.將包埋模具置于干冰上，蓋上干冰盒蓋子，或者微敞開放入-80冰箱速凍
7.待組織塊變白后，包埋完成，可以連同包埋模具一同保存運(yùn)輸
?
包埋流程
拍照記錄樣本信息
二、新鮮組織OCT包埋時(shí)注意事項(xiàng)
1.包埋時(shí)盡量排空氣泡，氣泡的產(chǎn)生會(huì)在OCT冷卻后在組織周圍形成空洞，致使切片時(shí)容易斷裂 ，影響切片效果, 成不了片；
2.對(duì)于需要觀察特定切面的組織（如血管橫截面等），可以在包埋時(shí)在組織底部墊襯與包埋盒底部面積等同的A4紙或?yàn)V紙，協(xié)助維持組織固定切面。必要時(shí)可以借助一些快干膠水做底部固定；
3.對(duì)于較小的需要同時(shí)幾個(gè)組織包進(jìn)一個(gè)包埋塊時(shí)（如類器官等組織），也可以在底部墊襯濾紙或者A4紙，使組織盡可能在同一平面上。
?OCT組織送樣
·?新鮮組織取下后建議立即包埋，不建議放在組織保護(hù)液里寄送，有降解風(fēng)險(xiǎn)；
·?我們會(huì)提前給老師寄一些包埋盒和鋁箔紙袋，包埋后的組織密封在袋子里，隔絕外部空氣和水分，保存會(huì)更好；
·?包埋后的組織放在鋁箔紙袋里在-80°C放置一天后再干冰寄送，保證組織的凝固效果同時(shí)防止RNA降解；
·?若模型樣本老師無法自己取材，可以寄送活體小鼠到公司，由動(dòng)物平臺(tái)取材，單細(xì)胞平臺(tái)協(xié)助進(jìn)行OCT包埋。需要支付動(dòng)物取材及尸體處理等費(fèi)用，同時(shí)需要給到取材的protocal,以及在送樣前對(duì)包埋的具體位置提出明確需求。
石蠟組織送樣
·?石蠟樣本保守需要切30-40片，按照一張切片5um的厚度，石蠟塊包含組織的厚度至少0.2mm；
·?石蠟樣本需在切片前確認(rèn)切片方向，樣本放到石蠟切片機(jī)上后無法再次調(diào)整方向;
·?石蠟樣本采用統(tǒng)一的透化條件，不需要透化預(yù)實(shí)驗(yàn)，但需要進(jìn)行粘附性預(yù)實(shí)驗(yàn)，如果有多個(gè)石蠟樣本，每一個(gè)都需要做粘附性預(yù)實(shí)驗(yàn)。
空轉(zhuǎn)選片
·?樣本收到后10個(gè)工作日內(nèi)我們會(huì)給到切片、HE染色以及RNA質(zhì)檢結(jié)果；
·?若樣本質(zhì)檢合格（OCT：RIN≥7；FFPE: DV200>50%)，?? 且HE染色形態(tài)相對(duì)完整，OCT樣本需要老師在給到的TTK格式的圖片（使用對(duì)應(yīng)軟件打開）中選定6.5*6.5mm2的目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行標(biāo)記，以便安排透化實(shí)驗(yàn)；
·?正式實(shí)驗(yàn)需要再次選片，需要提前跟老師約好選片時(shí)間；
·?空轉(zhuǎn)不能使用免疫熒光的樣本，我們可以給老師做免疫熒光的染色來確定位置，OCT包埋好的組織塊，切下來的切片先嘗試做免疫熒光，并結(jié)合HE染色的結(jié)構(gòu)區(qū)域，一起摸索可用的區(qū)域在哪里，之后緊接著重新切片做HE染色和透化等空轉(zhuǎn)后續(xù)實(shí)驗(yàn)；
·?如果老師有免疫熒光或者免疫組化的需求，或者需要切出多余的白片寄回給老師，均需要在售前充分溝通，比如需要的白片厚度、需要觀察的目的區(qū)域結(jié)構(gòu)等，技術(shù)平臺(tái)也會(huì)根據(jù)經(jīng)驗(yàn)給出對(duì)應(yīng)的建議。如果老師給到現(xiàn)成的抗體最佳孵育濃度和時(shí)間，我們可以使用老師現(xiàn)有參數(shù)，給客觀結(jié)果，否則還需要摸索免疫熒光的條件。
特殊樣本空轉(zhuǎn)注意事項(xiàng)
一、骨組織
- 骨組織空轉(zhuǎn)一般質(zhì)檢都比較難通過，特別是對(duì)于骨齡比較大的樣本；
- 即便質(zhì)檢通過，后面切片也不好切，很容易切碎；
- 骨組織貼片的時(shí)候也比較容易脫片；
- 對(duì)于石蠟骨組織，樣本本身可能細(xì)胞也比較少，空轉(zhuǎn)捕獲到的spot數(shù)可能偏少；
- 骨組織石蠟樣本除了容易脫片，且因?yàn)椴淮_定透化即RNA釋放的效果，不能保證探針對(duì)RNA的捕獲效率，進(jìn)而導(dǎo)致最后測(cè)到的基因數(shù)進(jìn)一步減少。
二、皮膚組織
- 皮膚組織切片不好切且透化困難；
- 皮膚樣本因?yàn)榉謱?，切片的時(shí)候如果縱切，各層暴露的面積太小，如果橫切，則很難切除一平層，這個(gè)風(fēng)險(xiǎn)需要老師知曉；
- 如果透化過度，細(xì)胞內(nèi)釋放的RNA會(huì)彌散，進(jìn)入附近組織區(qū)域，比如說老師這個(gè)皮膚組織，可能原本應(yīng)該是真皮層細(xì)胞表達(dá)的基因，最后檢測(cè)分析在皮膚的表皮層的角質(zhì)層有表達(dá)，那就沒辦法解釋；
- OCT包埋以后本身組織就是一團(tuán)了，切的時(shí)候就算客戶標(biāo)記好方向，但因?yàn)槠つw層的特殊性，也很難完全正好一類細(xì)胞橫切一層；
- 如果最后透化失敗無法繼續(xù)向下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，老師也要承擔(dān)前序包括HE染色、切片、RNA質(zhì)檢、透化等費(fèi)用。
三、血管組織
?
?
- 人的血管樣本通常有疾病模型，雜質(zhì)較多，質(zhì)檢不容易通過；
- 血管如果剪開了平切，容易只切到某一種細(xì)胞層；
- （內(nèi)膜/中膜/外膜），不能包含所有細(xì)胞類型；如果縱切；
- 由于血管壁的中空結(jié)構(gòu)，包埋時(shí)容易產(chǎn)生空泡；
- 小鼠血管較軟，相對(duì)不容易包埋，對(duì)包埋技術(shù)要求較高；
- 基于血管壁的厚度（人動(dòng)脈直徑2.8～3.0cm,厚度約1mm;
- 小鼠動(dòng)脈直徑0.8mm,厚度約0.06mm)，取橫截面貼片；
- 血管中間的部分是空白的，只要周圍一圈血管壁才能覆蓋芯片；
- 對(duì)空轉(zhuǎn)芯片捕獲區(qū)域的利用率相對(duì)較低。
四、脊髓/骨髓組織
- 脊髓一般分離出來是半固態(tài)，長(zhǎng)條狀，如果要做空轉(zhuǎn)，OCT包埋時(shí)候需要老師將脊髓平鋪包埋并標(biāo)記號(hào)方向，這個(gè)有一定難度；
- 我們質(zhì)檢一般切片厚度10um, 脊髓很薄，不好確定脊髓橫切面，有找不到老師要的病理區(qū)域的風(fēng)險(xiǎn)，可能切不了幾刀就切穿了；
- 骨髓也比較軟，不太好包埋，可能組織會(huì)變形；
- 切片的時(shí)候，骨髓容易切碎（連帶著骨頭一起碎掉，破壞骨髓的組織形態(tài)）。
五、角膜組織
- 需要確定橫切還是縱切面，空轉(zhuǎn)一個(gè)spot 55μm，點(diǎn)與點(diǎn)之間相距100μm,如果連2個(gè)點(diǎn)都覆蓋不到，那肯定需要橫切；
- 橫切的話需要保證在一個(gè)平面，如果老師角膜有弧度，包埋需要盡量保證在一個(gè)平面；
- 一般小的組織做空轉(zhuǎn)都需要考慮樣本的厚度和面積，老師不確定的可以做預(yù)實(shí)驗(yàn)。