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我們特別選擇了一組2019冠狀病毒疾病血清樣本，這些樣本涵蓋了大量SARS-CoV-2特異性抗體濃度。通過對三聚體棘突蛋白和RBD蛋白用于血清學分析中檢測SARS-CoV-2特異性IgG。發(fā)現(xiàn)新冠病毒樣本的中值信號強度比對照樣本高400倍以上（圖5a）。統(tǒng)計分析顯示，S1單體和兩種RBD的ROC之間沒有差異，武漢和D614G三聚體棘突之間也沒有差異。此外，我們的結(jié)果表明，CHO產(chǎn)生的三聚體棘突比S1單體和RBD具有更高的診斷特異性和敏感性。

圖 5. CHO產(chǎn)生的三聚體棘突具有更高的診斷特異性和敏感性（a）在癥狀出現(xiàn)的第4-40天收集的對照血清（n=151）和 2019冠狀病毒疾病血清（n=72）進行了測試，并比較了免疫球蛋白G的濃度。（b）用 ROC分析（a）中檢測的血清。

Cytena單細胞打印機溫和篩選的原理保證了CHO具有較高的活性，為下游的擴展生產(chǎn)工藝奠定了基礎(chǔ)，以提供足夠數(shù)量的具有哺乳動物型糖基化的三聚體SARS-CoV-2棘突蛋白。功能分析表明，三聚體SARS-CoV-2棘突蛋白能夠有效地阻斷病毒的傳染性。此外，三聚體棘突對SARS-CoV-2特異性IgG的診斷性能超過RDB和單體S1蛋白。

參考文獻：

[1].Kirtipal N , Bharadwaj S , Kang S G . From SARS to SARS-CoV-2, insights on structure, pathogenicity and immunity aspects of pandemic human coronaviruses[J]. Infection Genetics and Evolution, 2020, 85:104502.[1] Kirtipal N , Bharadwaj S , Kang S G . From SARS to SARS-CoV-2, insights on structure, pathogenicity and immunity aspects of pandemic human coronaviruses[J]. Infection Genetics and Evolution, 2020, 85:104502.

[2]. Pino P , Kint J , Kiseljak D , et al. Trimeric SARS-CoV-2 Spike Proteins Produced from CHO Cells in Bioreactors Are High-Quality Antigens[J]. Processes, 2020, 8(12).Pino P , Kint J , Kiseljak D , et al. Trimeric SARS-CoV-2 Spike Proteins Produced from CHO Cells in Bioreactors Are High-Quality Antigens[J]. Processes, 2020, 8(12).

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Cytena公司潛心研究單細胞打印機技術(shù)多年，不斷升級設(shè)備功能，以一貫溫和的分選原理、更加快速的分選效率、更加簡易的操作步驟，助力抗體、細胞治療、基因治療、干細胞等研究領(lǐng)域的客戶快速搭建單細胞篩選平臺。艾貝泰生物科技有限公司作為Cytena的單細胞打印機總代理商，為您提供最優(yōu)質(zhì)的售前售后服務(wù)。

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因此，認識和理解COVID-19感染途徑和發(fā)病機制對其防控和治療具有重要意義。作為新平臺，單細胞技術(shù)的成熟在整個生命科學領(lǐng)域的廣泛應用催生了許多重要的生物學發(fā)現(xiàn)，也意味著在臨床研究上會有一批新的突破，所以單細胞分離篩選在SARS-CoV-2研究中起到尤為重要的作用。

新冠病毒的起源發(fā)展

自20世紀30年代末以來，人們就知道了動物冠狀病毒，最近的研究將Human coronaviruses (HCoVs）的進化與加速的城市化和家禽養(yǎng)殖聯(lián)系起來；這些做法允許頻繁的物種交換和簡化物種屏障的跨越，研究人員通過研究SARS-CoV-2和相關(guān)sarbecovirus （SARS-CoV-2屬于蝙蝠和穿山甲病毒的病毒群）的突變過程發(fā)現(xiàn)了相當顯著的變化，早在1983年，有證據(jù)強烈表明單峰駱駝是MERS CoV的重要宿主；據(jù)預測，這種祖?zhèn)鞑《緯尿鹕砩峡缭轿锓N屏障，進入單峰駱駝體內(nèi)。后來，穿山甲被認為是SARS-CoV-2的潛在中間宿主，因為它與穿山甲中的CoV具有99%的遺傳同源性；但它們都是在SARS-CoV-2出現(xiàn)在人類之前。這也說明，許多冠狀病毒具有“通才”的特性且在宿主之間跳躍能力明顯，而這一特性使得冠狀病毒可能在傳染給人類之前就已經(jīng)在蝙蝠中得到進化了^[1]。

圖1. 冠狀病毒的起源和向人類的傳播途徑

大流行的人類冠狀病毒的棘突蛋白對于其進入人體細胞至關(guān)重要。事實上，大多數(shù)針對嚴重急性呼吸系統(tǒng)綜合冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 的中和抗體是針對病毒表面暴露的棘突蛋白，使其成為疫苗和診斷測試的首選抗原。在當前大流行的背景下，全球?qū)坏鞍椎男枨笱杆僭黾樱磕昕赡艹^數(shù)百克至公斤。冠狀病毒棘突是高度糖基化的同源三聚體復合物，具有固有的結(jié)構(gòu)靈活性和不穩(wěn)定性。可制造性差現(xiàn)威脅到這些蛋白質(zhì)用于疫苗和診斷測試的可用性。所以尋求一種能夠穩(wěn)定生產(chǎn)三聚體棘突蛋白(Trimeric spike protein，S蛋白）的工藝尤為重要。

SARS-CoV-2 S蛋白的設(shè)計

SARS-CoV-2 S蛋白的編碼DNA的密碼子經(jīng)過優(yōu)化，一共設(shè)計了11個DNA結(jié)構(gòu)體（圖2），并由ATUM公司合成。添加了一個功能性IgG先導序列來介導有效的信號肽切割。添加編碼組氨酸（8-聚體）的DNA用于羧基末端表達。如前所述，furin裂解位點RRAR突變?yōu)榉枪δ苄浴Ｔ谌垠w設(shè)計中，將跨膜區(qū)和C端細胞內(nèi)的尾端去除，用一個T4折疊子序列取代。對于RBD片段（aa319-541），添加了IgG leader和His標簽序列。由于攜帶D614G氨基酸變化的SARS-CoV-2變異體的廣泛出現(xiàn)，本研究中也包括了這種棘突蛋白變異 。

圖 2. Schematic representation of SARS-CoV-2 spike protein designs.

單克隆細胞株的篩選和三聚體棘突蛋白表達

采用CHO4Tx的轉(zhuǎn)染試劑，在無動物來源的培養(yǎng)基中，將包含SARS-CoV-2 棘突蛋白的DNA序列的pXLG-6載體轉(zhuǎn)染CHOExpress^TM細胞。該載體包括用于嘌呤霉素抗性標記物的表達盒。轉(zhuǎn)染后的細胞用嘌呤霉素進行篩選，對于wuhan突變毒株，采用德國 cytena 的 f.sight 單細胞打印機篩選單克隆細胞株。將高水平表達的三聚體S蛋白和RDB單體的細胞株擴增并凍存。RBD棘突片段的重組細胞系和三聚體S蛋白的克隆細胞系在優(yōu)化的補料分批工藝中，以0.2-，10-和50-L的生物反應器中放大培養(yǎng)。

從300個單克隆衍生的細胞群中，挑選出三聚體棘突（trimeric spike）和受體結(jié)合域（RBD）表達水平最高的細胞群進行擴增，并開發(fā)了補料分批生產(chǎn)工藝。生產(chǎn)過程逐步擴大到200mL搖瓶、10L和40L攪拌槽生物反應體系。活細胞密度（VCD）和存活率可保持高達10天（圖3）。觀察到三聚體棘突蛋白和RDB單體在各種培養(yǎng)規(guī)格下最終收獲滴度均為數(shù)百毫克/升。