近日，來自南京大學醫學院附屬鼓樓醫院運動醫學與成人重建外科史冬泉團隊在Science Advances上在線發表了題為Articular fibrocartilage-targeted therapy by microtubule stabilization的工作。該工作首次提出基于纖維軟骨為基礎的透明軟骨修復策略，并命名為“纖維軟骨透明化”。同時，利用微管穩定的機制有效促進纖維軟骨細胞的纖維化指標下降，提高透明軟骨細胞外基質的合成，證明了纖維軟骨透明化的可行性和有效性。
研究思路及方法
1.?構思纖維軟骨透明化策略
纖維軟骨一直被認作為軟骨修復失敗的標志。作者認為纖維軟骨作為自我修復的產物有其自身價值（1、纖維軟骨可直接作為軟骨修復的 自體生物支架；2、纖維軟骨中含有天然的種子細胞；3、新生纖維軟骨與宿主軟骨/ 軟骨下骨高度一體化），因此假設存在一種可以利用纖維軟骨作為原生材料來實現透明軟骨修復的方法?；诖耍岢隽艘粋€嶄新的軟骨修復策略-“纖維軟骨透明化”，實現纖維軟骨透明化策略主要包括兩個角度，其一針對原位的纖維軟骨細胞進行改造，其二針對原位的纖維軟骨機制進行重塑（圖2）。
2.?探索纖維軟骨形成過程的變化
作者首先在SD大鼠的股骨滑車溝內構建了軟骨缺損模型，分別在手術后第2周，第4周，第6周獲取了大鼠膝關節樣本。在進行組織學分析后發現大鼠軟骨損傷過程中，在缺損區域內形成的新生軟骨組織均是同時還表達一型膠原（Col I）和二型膠原（Col II）的纖維軟骨組織。與此同時，在人的纖維軟骨組織內，作者還發現其具有較高表達的金屬基質蛋白酶-13 (MMP13), 說明纖維軟骨同時具有較高的分解代謝水平，會對自身和周圍健康軟骨組織造成進一步影響。進一步分析發現，作為穩定微管的標志物，乙酰化的微管蛋白（Ace-tubulin）在纖維軟骨中從損傷早期到晚期的表達是明顯下降的。同時基于作者前期的研究工作中微管穩定可以促進滑膜間充質干細胞成軟骨分化（JW Li et.al. 2021. Front Cell Dev Biol），說明纖維軟骨的形成和微管穩定存在一定聯系。
?3.?纖維軟骨細胞體外模型的建立
作者通過結締組織生長因子（CTGF）和轉化生長因子（TGF-β1）對大鼠骨髓間充質干細胞的誘導獲得了誘導性的纖維軟骨細胞（induced fibrotic chondrocytes，iFCs）。對獲得的iFCs進行mRNA轉錄組學測序分析，結果發現iFCs高表達纖維化相關的指標，同時與軟骨保護相關的指標有所降低。進一步的蛋白表達實驗結果也證實了iFCs的纖維軟骨細胞表型。
?4.?體外微管穩定治療纖維軟骨細胞
作者使用經典微管穩定藥物多西他賽（Docetaxel）作用與獲得的iFCs，隨后進行mRNA轉錄組學測序分析，結果表明基因組中纖維化相關的基因，如Col1a1，Fmod以及Col3a1表達都有所下降，另外與細胞骨架相關的基因有所上升。蛋白表達檢測實驗進一步證實了該結果。同時，軟骨小球培養實驗和軟骨微團培養試驗也證實了微管穩定在纖維軟骨透明化中的潛能。
5.?構建纖維軟骨靶向治療體系
基于此，作者根據纖維軟骨的電荷特性，設計了一種靶向纖維軟骨的藥物緩釋體系，用于體內的纖維軟骨透明化治療。合成后的生物支架能夠在29℃左右交聯成膠，因此在低溫情況下能有效完成膝關節腔的注射操作，利于治療的進行。同時因為生物支架中的顆粒攜帶負電荷，因此能夠在注射后有效的粘附與纖維軟骨表面，進行藥物緩釋。
作者將構建好的纖維軟骨靶向治療生物支架在大鼠軟骨缺損模型建立后的第四周進行膝關節腔注射治療。免疫熒光實驗結果顯示治療組損傷區域的Ace-tubulin表達明顯升高，說明微管穩定得到有效提升。通過MicroCT以及進一步的組織學分析，結果表明在大鼠軟骨缺損模型構建后的中晚期（纖維軟骨形成后），可以觀察到在損傷區形成的纖維軟骨重新展現出了透明軟骨的表型，從而基本驗證了通過微管穩定實現纖維軟骨透明化的可行性。
7.?微管穩定促進人退表軟骨的透明化表型
作者獲取全膝關節置換術后人膝關節軟骨樣本，將其分為對照組和微管穩定組進行外植體培養試驗。在外植體培養中，多西他賽孵育能夠明顯提高軟骨細胞的Ace-tubulin的表達水平。進一步的蛋白表達試驗和組織學分析均表明，微管穩定能夠有效將退變纖維軟骨往透明軟骨的方向轉變。
8.?微管穩定促進纖維軟骨透明化的機制探索
作者通過對兩次mRNA轉錄組測序分析的結果進一步分析，發現Sparc基因在纖維化時升高，微管穩定時降低，結合蛋白互作分析（PPI）進一步說明該基因為纖維軟骨形成以及微管穩定促進纖維軟骨透明化的機制密切相關。通過動物實驗體內的驗證以及小干擾RNA實驗對Sparc蛋白的敲減進一步明確了Sparc在纖維軟骨透明化機制中的重要作用。
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研究總結
該研究首次將纖維軟骨作為原材料進行軟骨修復治療，提出“纖維軟骨透明化”的全新治療策略，突破了原有軟骨修復研究的傳統壁壘。并且使用針對纖維軟骨細胞微管穩定的方法驗證了纖維軟骨透明化的可行性。該研究證實了原位纖維軟骨透明化策略在軟骨修復中的應用效果和治療前景，有望成為骨關節炎和軟骨損傷相關疾病新的治療策略和研究方向，也為軟骨病理生理機制研究提供新的理論基礎。
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作者簡介
南京大學醫學院附屬鼓樓醫院史冬泉教授為該論文的通訊作者，南京大學醫學院李嘉威博士為該論文的第一作者。
?右：史冬泉教授（通訊作者）
?左：李嘉威博士（第一作者）