在LC-MS/MS蛋白質(zhì)鑒定實(shí)驗(yàn)中， 由于化學(xué)污染、電氣噪聲、低質(zhì)量的準(zhǔn)確性， 以及意料之外的翻譯后修飾（PTM） 和MS / MS碎片模式， 使用搜索引擎進(jìn)行大批量解析譜圖過程，可能導(dǎo)致肽段鑒定結(jié)果存在大量假陽性。另外，搜索引擎算法上存在的缺陷也會(huì)造成肽段-譜圖匹配（Peptide Spectrum Maches，PSMs）的錯(cuò)誤。因此，人工驗(yàn)證PSMs質(zhì)量成為必要，尤其對(duì)于特定的研究目的（如多肽鑒定，目標(biāo)蛋白識(shí)別等）或特定蛋白，這時(shí)候就需要我們用自己的火眼金睛來判斷譜圖與給定肽段序列的匹配情況了。除此之外，有些雜志也要求提供特定肽段的PSM峰圖。
今天給大家推薦一款關(guān)于譜圖標(biāo)峰實(shí)用的小工具——pLabel，并手把手教會(huì)大家如何使用。
今天給大家推薦一款關(guān)于譜圖標(biāo)峰實(shí)用的小工具——pLabel，并手把手教會(huì)大家如何使用。
1. pLabel介紹
pLabel? （當(dāng)前版本，v2.4.05）是一款專門用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的質(zhì)譜峰標(biāo)注軟件（mass spectral peak labeling software）。主要提供如下功能：
1）支持批處理，質(zhì)譜數(shù)據(jù)和搜索引擎的搜索結(jié)果可同時(shí)直接導(dǎo)入；
2） 支持多種質(zhì)譜數(shù)據(jù)格式（mgf，dta，ms2），搜索引擎檢索結(jié)果（pFind，Mascot，SEQUEST）；
3）支持ECD/ETD碎裂模式的譜圖標(biāo)峰；
4）根據(jù)用戶定制的片段離子類型，在已知的PSM中突出顯示不同顏色的匹配峰（如b離子峰為綠色、y離子峰為紅色）
5）可同時(shí)實(shí)現(xiàn)多個(gè)氨基酸位點(diǎn)，多種翻譯后修飾的標(biāo)峰；
6）支持中性缺失標(biāo)峰功能；
7）支持相關(guān)統(tǒng)計(jì)功能；
8）輸出圖片支持多種格式（png，bmp，tiff，jpg），可以單張導(dǎo)出或批量導(dǎo)出。
2、資源獲取及安裝
從下面鏈接下載Find軟件：http://pfind.ict.ac.cn/software/pLabel/index.html。解壓后找到plabel文件夾，找到plabel.exe，然后雙擊，開始安裝。注意，pLabel目前只支持Windows環(huán)境系統(tǒng)。
3、軟件使用
1）質(zhì)譜原始文件導(dǎo)入（step1）
本文以MGF格式文件為例(gel_ID_002_MGFPeaklist.mgf)：
-
打開軟件，導(dǎo)航欄單擊FILE按鈕；
-
Load MS/MS File→選擇MGF格式類型→導(dǎo)入MGF文件。
Step 1. MGF文件導(dǎo)入
這一步相當(dāng)于將對(duì)應(yīng)mgf文件中的所有二級(jí)譜圖導(dǎo)入了plabel中。
2）查看所有譜圖和指定譜圖
-
點(diǎn)擊界面右側(cè)的All按鈕，會(huì)彈出mgf文件中的所有二級(jí)譜圖的title
-
在彈出的界面中選擇一個(gè)，或者在左下角輸入所關(guān)注的二級(jí)譜的title，然后點(diǎn)擊確定，此時(shí)plabel界面就會(huì)顯示對(duì)應(yīng)的二級(jí)譜圖。例如，本文想觀察譜圖編號(hào)為1.1.1.1109.3的二級(jí)譜。關(guān)于怎么知道所關(guān)心的譜圖編號(hào)（或title），請(qǐng)繼續(xù)往下看。
Step2. 選擇特定譜圖
3） 選擇特定譜圖-肽段，并對(duì)其進(jìn)行譜峰標(biāo)注
本文以Proteinpilot結(jié)果為例。譜圖編號(hào)為1.1.1.1164.6，肽段序列為LDSELKNMQDMVEDYR，可變修飾為8號(hào)氨基酸的Oxidation(M)和11號(hào)氨基酸的Oxidation(M)。
-
按照2）步驟選擇譜圖1.1.1.1164.6。
-
將肽段LDSELKNMQDMVEDYR復(fù)制粘貼到界面左下角的SEQ欄。
-
設(shè)置參數(shù)。勾選Show Info，勾選Show Peak Mass，勾選Show Neutral Loss，勾選Show AA sequence，TOL：0.1，Threshold：1.0。其它參數(shù)默認(rèn)。
-
在對(duì)應(yīng)位點(diǎn)添加可變修飾（單擊左上角的mod選項(xiàng)）。
-
點(diǎn)擊Update。此時(shí)界面出現(xiàn)了譜圖的標(biāo)峰圖
-
右擊圖片界面空白處，保存圖片。
-
至此，對(duì)特定譜圖-肽段的的標(biāo)峰完成了。
Step3. 譜圖肽段標(biāo)峰
4）高級(jí)設(shè)置
自定義需要標(biāo)注的碎片離子類型
默認(rèn)下，plabel只標(biāo)注-b和-y系列離子。我們可以根據(jù)質(zhì)譜儀的型號(hào)與采集模式標(biāo)注其他類型碎片離子。方法如下（step4）：
-
點(diǎn)擊下方導(dǎo)航欄中的Ion Type Select按鈕；
-
選擇需要添加的離子類型。對(duì)大多數(shù)質(zhì)譜儀將肽段母離子碎裂成b、y系列離子（一價(jià)或二價(jià)），并且有中性丟失的情況發(fā)生。因此，我們添加b、y的中性丟失；
-
點(diǎn)擊下方導(dǎo)航欄的Main info返回設(shè)置主界面。點(diǎn)擊Updat，會(huì)發(fā)現(xiàn)在標(biāo)峰圖中多了相應(yīng)的譜圖標(biāo)注信息。
Step4. 選擇其他類型的碎片離子
自定義修飾類型
有時(shí)候，默認(rèn)的plabel中的修飾類型不包含想要添加的類型。這時(shí)候就需要我們自己動(dòng)手添加了。以譜圖1.1.1.1114.2和對(duì)應(yīng)的肽段AQYEDIAQK為例，其修飾類型為：Methyl(D)@5;Formyl(K)@9。發(fā)現(xiàn)默認(rèn)的plabel中沒有這兩個(gè)修飾。在添加新修飾類型之前我們需要確定以下信息：修飾基團(tuán)的分子量（單一同位素分子量和平均同位素分子量）、修飾位點(diǎn)和中性缺失。這些信息可以直接在對(duì)應(yīng)的搜索引擎中尋找，也可以到unimod官網(wǎng)上查看（http://www.unimod.org/modifications_list.php），如下，
Unimod查找：
-
進(jìn)入網(wǎng)頁，以guest身份登錄；
-
將修飾名稱（Methyl）輸入到搜索欄，點(diǎn)擊Search按鈕；
-
在出現(xiàn)的結(jié)果中找到Methyl，ID為34，點(diǎn)擊View進(jìn)入該修飾界面；
-
可以看到，Methyl修飾的化學(xué)式為H(2)C，單一同位素（Monoisotopic）分子量為14.015650，平均同位素(Average)分子量為14.0266，無中性丟失?？砂l(fā)生Methyl修飾的氨基酸包括C,H,K,N,N-term,Q,R,I,L等。
將Methyl修飾添加到plabel中（step5）：
-
按照前述步驟選擇譜圖1.1.1.1114.2，輸入肽段AQYEDIAQK
-
點(diǎn)擊plabel上方主導(dǎo)航欄中的ion按鈕；
-
選擇Mass Config→Modification→Add，此時(shí)會(huì)彈出添加修飾類型的小窗口；
-
添加自定義修飾。Name為自定義名字，最好能夠顧名思義，以方便以后使用。本示例輸入Methyl（D）；Site為發(fā)生修飾的位點(diǎn)，輸入D；Modification Type為修飾類型，為NORMAL；Mass（Mono）：14.015650，Mass（Avrg）：14.0266。點(diǎn)擊OK保存；
-
同樣的方法添加Formyl（K）修飾；
-
按前述步驟將Methyl(D)@5; Formyl(K)@9添加到序列中。
Step5. 添加未知修飾類型
我們發(fā)現(xiàn)，添加這兩種修飾后，更多的碎片離子得到了標(biāo)注（如圖）
除了上述介紹的功能外，Plabel還可以自定義標(biāo)峰的顏色、字體，以及需要顯示的信息。童鞋們可以探索一下。學(xué)習(xí)過程有什么問題請(qǐng)留言哦！