作為最簡單經濟的外源蛋白表達方法，大腸桿菌外源蛋白表達技術深受大眾青睞，是最常用的表達方式。但是對小小的細菌而言，這些不速之客—外源蛋白，到底受不受歡迎呢？
有的情況下大腸桿菌對這個不速之客毫不客氣，等表達出來結果一看，完全沒有目的條帶，出現這種情況可能是因為：
①二級翻譯起始位點的影響。當基因起始密碼子后面有一個與核糖體結合位點（RBS）時，核糖體也會從這個位點開始翻譯可能導致截短、移碼等。
原核基因的核糖體結合位點SD序列是mRNA起始密碼子上游約4~7 bp前的一段富含嘌吟短序列（5’-AGGAGG-3’）。這段序列與16S rRNA 3’端 3’-UCCUCC-5’區段完全互補，幫助16S rRNA識別以及從起始密碼子處開始翻譯。SD序列越強則基因表達水平越高，SD序列中GGAGG是弱SD序列偏好模式，AAGGA是強SD序列偏好模式，并且同一模式中SD序列距起始密碼子的距離不同所起到的調控作用也不同。例如，GGAG模式中堿基A在強SD序列中位于-8位，在弱SD序列中位于-7和-9位。
另外，在真核基因中核糖體會識別Kozak序列并將其作為翻譯起始位點。Kozak序列是一段位于起始密碼子上下游的模式，為—G/N-C/N-C/N-ANNATGG—的短序列，其中3位的A堿基對翻譯效率有著重要影響。根據Kozak規則（見下圖），—GCCACCATGG—、—GCCATGATGG—的序列轉錄和翻譯效率最高。所以，真核表達中的引物設計需在ATG前加上—GCCACC—促進目的蛋白的表達。
②稀有密碼子影響。密碼子總共有64種，多數物種不會以相同的頻率使用而是有偏愛性地使用其中一部分，我們稱某個物種不常用的那些密碼子為稀有密碼子。例如在大腸桿菌、酵母細胞、果蠅體內表達高豐度蛋白的mRNA序列里表現出某種程度的密碼子偏愛。每個物種偏愛的密碼子不盡相同，在進行蛋白表達時，外源蛋白基因含有的某些密碼子因為不被宿主細胞所偏愛可能會導致表達效率低下。
在翻譯過程中，核糖體在稀有密碼子組成的mRNA上的移動速率比不含稀有密碼子的慢，成簇的稀有密碼子則會抑制核糖體的移動。當稀有密碼子簇位于mRNA的3’端或5’端時均會顯著降低蛋白的表達水平，散在分布的稀有密碼子對蛋白翻譯的影響則有負面效應。在大腸桿菌外源蛋白表達中，某些外源基因本身含有較多稀有密碼子，在起始密碼子后15 bp內的稀有密碼子會對蛋白表達有著顯著的影響，可以使用基因合成的方式進行密碼子優化，不過這種方法對原核宿主內表達蛋白有較好的效果，卻對真核宿主的影響不大，只能起到錦上添花的效果。
③mRNA二級結構的影響。如果基因序列里存在與核糖體結合位點和/或翻譯起始位點互補的序列，則轉錄形成的mRNA可能會形成二級結構，導致翻譯停止?？梢圆捎猛x密碼子替換的方式進行優化，即采用基因合成的方式進行優化，提高目的蛋白的表達量。
④GC含量的影響。眾所周知，GC含量在PCR反應中是一個重要指標。除此之外，基因的GC含量也影響著轉錄出的mRNA熱力學穩定性及二級結構，如果表達序列中GC含量超過70%則可能會導致蛋白在大腸桿菌中表達水平降低。
⑤轉錄終止子的影響。轉錄終止子可以促進蛋白的表達，缺少時就會造成“通讀”，也就是轉錄一直進行下去。在pET系列載體里目的基因的反方向有一個選擇性標記基因防止目的基因轉錄時發生“通讀”，要是目的基因的方向與這個標記基因方向一致（不同的載體標記基因的方向是不一定的）而且后面沒有一個終止子，那么目的基因就會和標記基因在轉錄過程中不斷競爭生成mRNA，可能會降低目的蛋白的表達量。
⑥mRNA的穩定性。大腸桿菌細胞內mRNA穩定性并不高，如果在mRNA 5’-非翻譯區和3’-rho非依賴性終止子處插入穩定結構序列，則可以起到增強mRNA穩定性的作用。例如mRNA 5’端的不帶突出的發夾結構能通過延長mRNA半衰期使其穩定性大大增加。
⑦翻譯終止效率。翻譯終止效率對蛋白的表達量有很大的影響，更有效的翻譯終止可以促進蛋白表達。絕大多數生物都有偏愛的圍繞終止密碼子的序列框架。例如，酵母和哺乳動物偏愛的終止密碼子分別是UAA和UGA，單子葉植物最常利用UGA，而昆蟲和大腸桿菌傾向于用UAA。大腸桿菌里終止密碼子序列—UAA(U)—可使翻譯效率達80%，而—UGA(C)—序列則只有7%。
有的情況下大腸桿菌對這個不速之客比較友好，但是卻把目的蛋白變成了包涵體而不是可溶形式在細胞里活蹦亂跳。包涵體是何方神圣？原來當外源基因在原核細胞中尤其是大腸桿菌中高效表達時，會聚集形成由膜包裹的高密度、不溶性顆粒，成分包括50%以上的重組蛋白及核糖體元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，包括環狀或缺口的質粒DNA，以及脂體、脂多糖等形式。這些顆粒的形成原因主要有以下幾種：
①表達量過高。當蛋白的合成速度過快，會使蛋白來不及正確折疊及形成正確的二硫鍵，加上包涵體的形成也能降低胞內外源蛋白的濃度更促進了包涵體的形成。所以某些蛋白在大腸桿菌里表達會形成大量的包涵體，這些過量的蛋白間非特異性結合起來，使得蛋白無法達到足夠的溶解度，形成包涵體。
②異源性影響。多數重組蛋白對大腸桿菌而言是異源的，大腸桿菌細胞內缺乏真核細胞翻譯后修飾所需的酶類，對某些需要修飾的真核蛋白，其在大腸桿菌里表達出來的蛋白中間體由于未得到及時修飾會大量積累形成沉淀。例如真核糖蛋白由于無法糖基化使得中間體聚集形成包涵體。
③分泌信號肽的影響。某些重組蛋白的分泌信號肽也會影響蛋白的折疊，它可能會使蛋白折疊成一個錯誤的構象導致錯誤折疊分子的產生，降低了蛋白的溶解度。
④蛋白氨基酸組成。通常蛋白序列里含硫氨基酸比例越高則越容易形成包涵體，而脯氨酸（Pro）的比例也明顯與包涵體的形成呈現正相關。
⑤環境因素。包涵體是由部分變性的中間體聚合而成，所以影響中間體穩定性的各種環境因素都可能導致包涵體的形成。例如大腸桿菌細胞內環境的pH如果接近目的蛋白等電點pI則容易形成包涵體，另外培養基的離子強度不合適、培養溫度過高等因素也可能引起中間體的聚合反應形成包涵體。
因此，在表達外源蛋白之前，要對目的基因及目的蛋白進行各方面的分析，選擇合適的表達載體、表達條件，才能得到理想的蛋白。