肌腱病是一種進行性肌肉骨骼疾病，其特征是肌腱的炎癥和退行性變化，導致疼痛、腫脹和功能受損，然而目前仍缺乏有效的治療方法。在肌腱病和其他疾病的起始和進展過程中，各種亞型的免疫細胞在炎癥級聯反應中發揮著關鍵作用。而在這些免疫細胞中，巨噬細胞能夠浸潤受損的肌腱，調節局部炎癥及愈合過程。巨噬細胞的表型包括M1和M2表型，其中M1巨噬細胞浸潤至損傷部位，釋放各種不利于組織修復的促炎細胞因子，而M2巨噬細胞能夠參與后期的愈合過程，具有清除細胞內病原體和促進肌腱再生的能力?；诖?，調節巨噬細胞的異質性可能是治療肌腱病變的一種有效治療途徑。
近年來，干細胞源性的小細胞外囊泡（sEVs）在各種疾病中的治療作用得到廣泛的關注。2020年，上海交通大學附屬第六人民醫院汪泱教授團隊于J Extracell Vesicles發表的“Human ESC-sEVs alleviate age-related bone loss by rejuvenating senescent bone marrow-derived mesenchymal stem cells”文章中，發現胚胎干細胞源性細胞外囊泡中含有多種年輕化因子蛋白成分，并能夠促進衰老小鼠骨髓間充質干細胞年輕化。此外，目前已有多項研究證實了sEVs治療肌腱病變的潛在機制。值得關注的是，一些針對成體干細胞衍生的大細胞外囊泡（lEVs）的研究表明，lEVs可能實現與sEVs類似的治療功能，而干細胞衍生的lEVs是否能夠有效治療肌腱病變尚不清楚。
2022年8月，汪泱教授團隊在細胞外囊泡的研究中再次獲得突破，于Bioactive Materials發表了題為“Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity“文章。文章研究了誘導性多能干細胞來源的間充質干細胞分泌的lEVs (iMSC-lEVs)在肌腱病變中的治療作用以及iMSC-lEVs在體外對巨噬細胞極化的調節作用。通過外泌體蛋白質組學、RNA測序、蛋白免疫印跡等技術方法，研究表明iMSC-lEVs能夠部分通過DUSP2和DUSP3來介導p38 MAPK信號通路，并使M1巨噬細胞向M2巨噬細胞進行極化轉變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。其中，中科新生命為該研究提供了細胞外囊泡蛋白質組學服務。
近年來，干細胞源性的小細胞外囊泡（sEVs）在各種疾病中的治療作用得到廣泛的關注。2020年，上海交通大學附屬第六人民醫院汪泱教授團隊于J Extracell Vesicles發表的“Human ESC-sEVs alleviate age-related bone loss by rejuvenating senescent bone marrow-derived mesenchymal stem cells”文章中，發現胚胎干細胞源性細胞外囊泡中含有多種年輕化因子蛋白成分，并能夠促進衰老小鼠骨髓間充質干細胞年輕化。此外，目前已有多項研究證實了sEVs治療肌腱病變的潛在機制。值得關注的是，一些針對成體干細胞衍生的大細胞外囊泡（lEVs）的研究表明，lEVs可能實現與sEVs類似的治療功能，而干細胞衍生的lEVs是否能夠有效治療肌腱病變尚不清楚。
2022年8月，汪泱教授團隊在細胞外囊泡的研究中再次獲得突破，于Bioactive Materials發表了題為“Large extracellular vesicles secreted by human iPSC-derived MSCs ameliorate tendinopathy via regulating macrophage heterogeneity“文章。文章研究了誘導性多能干細胞來源的間充質干細胞分泌的lEVs (iMSC-lEVs)在肌腱病變中的治療作用以及iMSC-lEVs在體外對巨噬細胞極化的調節作用。通過外泌體蛋白質組學、RNA測序、蛋白免疫印跡等技術方法，研究表明iMSC-lEVs能夠部分通過DUSP2和DUSP3來介導p38 MAPK信號通路，并使M1巨噬細胞向M2巨噬細胞進行極化轉變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。其中，中科新生命為該研究提供了細胞外囊泡蛋白質組學服務。
iMSC-lEVs在活體肌腱病變模型中的治療機制及巨噬細胞復極調節機制示意圖
研究材料
iMSC-lEVs；iMSC-sEVs；小鼠巨噬細胞細胞系RAW 264.7；大鼠肌腱病變模型；肌腱病患者肌腱組織
技術路線
- iMSC-sEVs和iMSC-lEVs的分離與表征；
- 建立大鼠肌腱病模型，并在體內評估iMSC-lEVs的鎮痛作用；
- 采用RAW 264.7細胞，研究iMSC-lEVs對巨噬細胞極化的調節作用；
- RNA-seq方法探究iMSC-lEVs調節巨噬細胞表型改變的機制；
- 對iMSC-lEVs進行蛋白質組學分析以確定其調控通路的上游蛋白；
- 研究iMSC-lEVs對肌腱病患者肌腱組織的作用。
研究結果
- iMSC-sEVs和iMSC-lEVs的分離與表征
研究人員采用誘導性多能干細胞（IPSC）來源的間充質干細胞(iMSCs)作為sEVs和lEVs的產生源。利用差速離心分離法從iMSCs培養基中分離并收集iMSC-sEVs (100 nm左右)和iMSC-lEVs (200nm以上)，并通過透射電鏡、Western blot、NTA粒徑分析對iMSC-sEVs與iMSC-lEVs進行表征。
圖1 iMSC-sEVs and iMSC-lEVs的分離與表征圖
2. iMSC-lEVs可減輕肌腱病相關疼痛并減少體內炎癥
研究人員首先建立了大鼠肌腱病模型，并在體內評估iMSC-lEVs的鎮痛作用。每周以100 μL lEVs（109粒/ml）劑量治療肌腱病變大鼠，與此同時在同一時間點以100 μL sEVs（1010粒/ml）劑量進行比較治療。采用靜態疼痛相關行為分析及步態分析對大鼠進行疼痛評估，結果表明，在治療4周后，應用lEVs能夠減輕肌腱病變大鼠的疼痛（圖2a）并顯著改善肌腱病變大鼠的動態行走模式（圖2b和c）。值得一提，結果表明lEVs治療具有與sEVs相似的鎮痛功能。此外，HE染色結果顯示，在治療4周后lEVs促進了肌腱病變中的肌腱修復（圖2d和e）。
接下來研究人員研究了lEVs對巨噬細胞表型浸潤的影響。 IHC染色結果顯示，在治療2周和4周后，lEVs治療減少M1巨噬細胞的浸潤，并促進M2巨噬細胞的浸潤（圖2d和e），且lEVs組與sEVs組無顯著差異（M1巨噬細胞浸潤可加重肌腱病相關疼痛，而M2巨噬細胞浸潤可改善肌腱病相關疼痛）。免疫組化染色顯示，治療2周和4周后，lEVs和sEVs治療均顯著降低促炎因子的表達（圖3a和b）。這些數據表明，lEVs治療在大鼠肌腱病變模型中具有抗炎和鎮痛作用，且與sEVs的能力相似。
接下來研究人員研究了lEVs對巨噬細胞表型浸潤的影響。 IHC染色結果顯示，在治療2周和4周后，lEVs治療減少M1巨噬細胞的浸潤，并促進M2巨噬細胞的浸潤（圖2d和e），且lEVs組與sEVs組無顯著差異（M1巨噬細胞浸潤可加重肌腱病相關疼痛，而M2巨噬細胞浸潤可改善肌腱病相關疼痛）。免疫組化染色顯示，治療2周和4周后，lEVs和sEVs治療均顯著降低促炎因子的表達（圖3a和b）。這些數據表明，lEVs治療在大鼠肌腱病變模型中具有抗炎和鎮痛作用，且與sEVs的能力相似。
圖2 iMSC-lEVs治療可改善疼痛相關行為并調節體內巨噬細胞浸潤
圖3 iMSC-lEVs治療降低大鼠體內炎癥細胞因子表達
3. iMSC-lEVs在體外調節M1巨噬細胞向M2巨噬細胞轉變
為了進一步研究iMSC-lEVs對巨噬細胞復極的調節作用，研究人員采用RAW 264.7作為研究對象。在驗證lEVs和sEVs可以被RAW 264.7細胞內化后，用100 ng/ml LPS刺激RAW 264.7細胞6 h，從而誘導為M1型巨噬細胞，然后分別用sEVs或lEVs處理48 h，而未受LPS刺激和處理的細胞被認為是M0型巨噬細胞。通過RT-qPCR分析，結果發現lEVs處理降低了促炎基因的表達，并增加抗炎基因的表達。進一步用流式細胞術分析表明，在lEVs治療后，M1巨噬細胞的百分比下降，而M2巨噬細胞的百分比增加。此外，108粒/mL的lEVs與109粒/mL的sEVs具有相似的功能。這些結果表明iMSC-lEVs能夠調節M1巨噬細胞向M2巨噬細胞轉變，并抑制炎癥（圖4）。
圖4 iMSC-lEVs在體外以劑量依賴性的方式調節巨噬細胞極化
4.iMSC-lEVs通過調節p38 MAPK信號通路部分調節巨噬細胞極化
為了研究iMSC-lEVs調節巨噬細胞極化轉變的機制，研究人員使用RNA-seq分析iMSC-lEVs處理后RAW 264.7細胞的基因表達。采用GSEA與IPA分析挖掘數據結果，顯示許多差異表達基因與炎癥過程高度相關，主要包括p38 MAPK信號通路等。為了驗證iMSC-lEVs可能通過調節p38 MAPK信號通路使巨噬細胞從M1極化至M2，研究人員通過Western blot檢測不同條件下巨噬細胞中p38的磷酸化水平。結果顯示，LPS刺激后p38的磷酸化水平上調，而lEVs處理后p38的磷酸化水平降低，說明lEVs可以抑制p38 MAPK通路的激活。之后研究者在iMSC-lEVs中加入p38 MAPK激動劑并與LPS刺激的RAW 264.7細胞共孵育48h，結果表明加入p38 MAPK激動劑后，M1巨噬細胞的百分比增加，M2巨噬細胞的百分比降低，說明lEVs的復極化調節功能部分被p38 MAPK信號通路的激活所阻斷。綜上結果，表明iMSC-lEVs調節巨噬細胞復極化至少部分是通過抑制p38 MAPK信號通路。
???????
圖5 RNA-seq分析LPS刺激的RAW 264.7細胞在iMSC-lEVs處理后的轉錄組變化
5.iMSC-lEVs可向巨噬細胞傳遞DUSP2和DUSP3
圖6 iMSC-lEVs的蛋白質組學分析
6、iMSC-lEVs調節人肌腱組織中巨噬細胞的異質性和浸潤性炎癥細胞因子
進一步的，研究者探究iMSC-lEVs在肌腱病患者中的效果。選取肌腱病患者的肌腱組織，并與iMSC-lEVs體外培養。結果顯示，iMSC-lEVs顯著降低M1巨噬細胞的比例，并增加M2巨噬細胞的比例。此外，iMSC-lEVs能夠降低炎性細胞因子IL-1β、tnf - α、IL-6和NGF的表達。這些數據與之前的動物實驗結果一致，從而進一步證實iMSC-lEVs對人體肌腱組織的有效性。
小結：
文章作者證明iMSC-lEVs能夠部分通過DUSP2和DUSP3介導p38 MAPK信號通路，使炎性巨噬細胞向抗炎巨噬細胞進行極化轉變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。這些發現揭示了iMSC-lEVs在免疫調節中的特殊作用，并強調了一種可改善肌腱病變和其他炎癥疾病的新型有效的無細胞療法。
圖5 RNA-seq分析LPS刺激的RAW 264.7細胞在iMSC-lEVs處理后的轉錄組變化
5.iMSC-lEVs可向巨噬細胞傳遞DUSP2和DUSP3
為了探究iMSC-lEVs調控p38 MAPK信號通路的潛在機制，研究者采用label free對iMSC-lEVs進行蛋白質組學分析，共鑒定出2208個蛋白質。對蛋白數據結果進行GO、KEGG以及IPA分析，發現負責p38去磷酸化的DUSP2(也稱為PAC1)和DUSP3在iMSC-lEVs中富集。此外Western blot分析表明，iMSC-lEVs培養后M1巨噬細胞中DUSP2和DUSP3的表達均升高。這些數據表明iMSC-lEVs可以將被包裹的DUSP2和DUSP3傳遞到巨噬細胞，從而調節p38信號通路。
圖6 iMSC-lEVs的蛋白質組學分析
6、iMSC-lEVs調節人肌腱組織中巨噬細胞的異質性和浸潤性炎癥細胞因子
進一步的，研究者探究iMSC-lEVs在肌腱病患者中的效果。選取肌腱病患者的肌腱組織，并與iMSC-lEVs體外培養。結果顯示，iMSC-lEVs顯著降低M1巨噬細胞的比例，并增加M2巨噬細胞的比例。此外，iMSC-lEVs能夠降低炎性細胞因子IL-1β、tnf - α、IL-6和NGF的表達。這些數據與之前的動物實驗結果一致，從而進一步證實iMSC-lEVs對人體肌腱組織的有效性。
小結：
文章作者證明iMSC-lEVs能夠部分通過DUSP2和DUSP3介導p38 MAPK信號通路，使炎性巨噬細胞向抗炎巨噬細胞進行極化轉變，從而減輕肌腱病變中的疼痛和炎癥。這些發現揭示了iMSC-lEVs在免疫調節中的特殊作用，并強調了一種可改善肌腱病變和其他炎癥疾病的新型有效的無細胞療法。