在生物制藥的下游純化過(guò)程中，離子交換層析（Ion Exchange Chromatography, IEX）因其分辨率高、處理量大、操作方便、適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)，成為抗體、疫苗、重組蛋白等生物大分子純化過(guò)程中不可或缺的關(guān)鍵步驟。
什么是離子交換層析？
原理
離子交換層析是一種基于帶電分子與填料表面電荷之間的靜電相互作用來(lái)實(shí)現(xiàn)分離純化的技術(shù)。目標(biāo)分子在一定pH條件下帶有正電或負(fù)電，可分別與陽(yáng)離子交換或陰離子交換填料結(jié)合。通過(guò)調(diào)節(jié)緩沖體系中的pH和電導(dǎo)率，可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子與雜質(zhì)的高效分離。
蛋白質(zhì)滴定曲線
• 蛋白質(zhì)滴定曲線的理解是設(shè)計(jì)離子交換工藝的關(guān)鍵之一，幫助我們確定最適結(jié)合和洗脫條件。
• 每種蛋白質(zhì)都有其獨(dú)特的凈電荷與pH的關(guān)系，可以將其顯示為滴定曲線。
• 在不同的pH條件下，不同的蛋白質(zhì)分子表面凈電荷不同，尋找合適的pH，使得目標(biāo)蛋白的表面凈電荷強(qiáng)度或者性質(zhì)與其他分子不同，從而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白與填料的結(jié)合強(qiáng)度與其他分子不同，從而達(dá)到分離純化。
注：當(dāng)分子所在溶液pH小于分子的pI（等電點(diǎn)）時(shí)，分子表面凈電荷為正（+）；當(dāng)分子所在溶液pH大于分子的pI時(shí)，分子表面凈電荷為負(fù)（-）。
Fig.1 蛋白滴定曲線
實(shí)驗(yàn)基本流程
• 平衡：用平衡緩沖液清洗層析柱至出口處的緩沖液的pH和電導(dǎo)率與平衡緩沖液基本一致，通常需要3~5CV。
• 上樣與清洗：按工藝載量進(jìn)樣，然后使用緩沖液清洗層析柱至紫外吸收接近基線。
• 梯度洗脫：采用線性或步級(jí)梯度提高鹽濃度，將不同結(jié)合強(qiáng)度的物質(zhì)從層析柱中洗脫，收集不同的組分。
• 再生：采用高鹽(如1~2M NaCl)及NaOH(如0.1~0.5M NaOH)進(jìn)行再生清洗，堿洗后需使用緩沖液清洗至中性。
Fig.2 典型離子交換實(shí)驗(yàn)流程示意圖
工藝優(yōu)化的關(guān)鍵點(diǎn)
• 選擇合適的填料種類與粒徑；
• 優(yōu)化緩沖液的pH與離子強(qiáng)度；
• 開(kāi)發(fā)并優(yōu)化合適的洗脫方式及條件等參數(shù)實(shí)現(xiàn)高效分離。
隨著生物工藝對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量要求的不斷提升，離子交換層析及離子交換填料的開(kāi)發(fā)正從“標(biāo)準(zhǔn)化工藝”向“精細(xì)化控制”方向發(fā)展。
離子填料的組成與分類
基本組成
離子填料主要由填料基架與配基組成。
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Fig.3 離子交換層析填料的組成
分類
離子交換填料根據(jù)配基的帶點(diǎn)性質(zhì)主要分為以下兩類：
• 陽(yáng)離子交換填料（Cation Exchange Resins）：配基帶負(fù)電，結(jié)合帶正電的分子。常見(jiàn)配基如磺酸（SP）、羧基（CM）。
• 陰離子交換填料（Anion Exchange Resins）：配基帶正電，結(jié)合帶負(fù)電的分子。常見(jiàn)配基如季胺（Q）、二乙基氨基乙基（DEAE）。
此外，配基根據(jù)其解離度是否隨pH顯著變化還有強(qiáng)弱離子型之分，決定了其在不同pH范圍內(nèi)的適用性。
Table 1.不同類型離子交換填料的特性
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應(yīng)用選擇建議
• 若工藝需要更寬pH穩(wěn)定性和更強(qiáng)結(jié)合力，優(yōu)選強(qiáng)離子交換劑；
• 若希望更精細(xì)選擇性或更溫和的結(jié)合/洗脫條件，優(yōu)選弱離子交換劑；
• 在放大工藝時(shí)，強(qiáng)交換劑更適合標(biāo)準(zhǔn)化操作，而弱交換劑適用于特定蛋白分離純化。
博格隆離子交換層析產(chǎn)品介紹
隨著市場(chǎng)和技術(shù)的發(fā)展，博格隆的產(chǎn)品形成了豐富的填料種類，可滿足不同應(yīng)用需求。
Table 2.博格隆離子交換層析產(chǎn)品
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應(yīng)用場(chǎng)景
離子交換層析被廣泛應(yīng)用于：
• 抗體純化中的中度及精細(xì)純化，用于雜蛋白去除；
• 疫苗生產(chǎn)中的病毒雜質(zhì)清除；
• 重組蛋白的高效捕獲。
應(yīng)用案例：Diamond CD-S在單抗中的純化
• 樣品：某單克隆抗體，調(diào)pH5.0，電導(dǎo)4mS/cm
• Buffer A：50mM NaAc-HAc，pH5.0，Cond：4mS/cm
• Buffer B：50mM NaAc-HAc + 0.5M NaCl，pH5.0
• Buffer C：0.5M NaOH
• 層析柱：Diamond CD-S
• 層析柱規(guī)格：BHR 5/17，2mL，柱高10cm
• 流速：6RT
Fig.4 Diamond CD-S層析圖譜
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
Table 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
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總結(jié)
在整個(gè)下游工藝中，離子交換層析不僅是“分離工具”，更是實(shí)現(xiàn)高純度產(chǎn)品質(zhì)量的“關(guān)鍵武器”。了解它、掌握它、優(yōu)化它，是每一位生物工藝開(kāi)發(fā)者的必修課。
博格隆的Diamond CD-S與MegaPoly BXS系列產(chǎn)品，可實(shí)現(xiàn)單抗、雙抗、ADC的高效、精準(zhǔn)、穩(wěn)定的分離，助力生物制藥流程優(yōu)化與降本增效。
訂購(gòu)與試用申請(qǐng)
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