近年來(lái)，多特異性抗體憑借同時(shí)識(shí)別多個(gè)靶點(diǎn)的能力，在腫瘤、自身免疫疾病等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。但與此同時(shí)，這類(lèi)分子在工藝開(kāi)發(fā)過(guò)程中往往表現(xiàn)出較高的pH敏感性。如何在滿足病毒安全性要求的前提下，降低病毒滅活步驟對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量的影響，已成為下游工藝開(kāi)發(fā)的重要課題。
然而由于其分子設(shè)計(jì)的復(fù)雜性，部分多特異性抗體對(duì)極端pH條件高度敏感，傳統(tǒng)低pH病毒滅活工藝易導(dǎo)致聚體和片段等雜質(zhì)的產(chǎn)生，從而影響產(chǎn)品的質(zhì)量、安全性和有效性。傳統(tǒng)的替代方法是在中性pH條件下使用有機(jī)溶劑/去垢劑（S/D）進(jìn)行孵育，但這種處理方式存在一些缺陷，例如處理體積和有機(jī)溶劑/去垢劑的使用量巨大，以及使用的TnBP的毒性和環(huán)境污染問(wèn)題。
因此，建立溫和、高效、可工業(yè)化放大的病毒滅活策略，是pH敏感型抗體藥物開(kāi)發(fā)與生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。
pH敏感型抗體的病毒滅活的核心挑戰(zhàn)
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)體系存在內(nèi)源性病毒與外源病毒污染風(fēng)險(xiǎn)，相關(guān)指導(dǎo)原則明確要求生物藥純化工藝需設(shè)置至少兩種正交機(jī)制的病毒清除步驟。單克隆抗體常規(guī)工藝以低pH孵育作為包膜病毒滅活核心單元操作，一般置于蛋白A親和層析低pH洗脫步驟之后。
影響低pH病毒滅活的主要因素包括pH、孵育時(shí)間、孵育溫度、緩沖體系等，其中pH值則是最主要的影響因素。由于低pH對(duì)抗體類(lèi)分子往往具有不利影響（如誘導(dǎo)抗體聚集等），該條件對(duì)多特異性抗體等pH敏感型分子存在顯著局限性。
S/D滅活技術(shù)的優(yōu)勢(shì)及局限
對(duì)于某些在低pH環(huán)境下不穩(wěn)定的分子，無(wú)法用低pH孵育進(jìn)行滅活病毒，此時(shí)則可選擇有機(jī)溶劑/去垢劑（S/D）進(jìn)行病毒滅活，該技術(shù)在血液制品的病毒滅活中有著長(zhǎng)期的應(yīng)用。
常用的有機(jī)溶劑/去垢劑包括TNBP、Triton X-100和PS80等。有機(jī)溶劑/去垢劑可單獨(dú)或混合使用，其關(guān)鍵工藝參數(shù)包括滅活溫度和時(shí)間等，但同時(shí)需要評(píng)估添加的有機(jī)溶劑/去垢劑對(duì)產(chǎn)品穩(wěn)定性和質(zhì)量的影響以及殘留情況。
通常情況下，建議將有機(jī)溶劑/去垢劑滅活放在下游純化的起始步驟（如向澄清的細(xì)胞培養(yǎng)液中添加含有1%聚山梨酯80（PS80）和0.3%磷酸三丁酯（TnBP）的S/D溶液），以便后續(xù)純化步驟可以進(jìn)行有效去除。
但是該模式在商業(yè)化規(guī)模的生產(chǎn)中有著明顯的短板：
• 處理體積大，有機(jī)溶劑/去垢劑的使用量高。2000L的細(xì)胞培養(yǎng)液需要添加6kgTnBP（Toxic Products），操作風(fēng)險(xiǎn)高；
• 需配置專(zhuān)用混合儲(chǔ)罐，增加廠房占用與設(shè)備投入；
• 需處理大量的有毒廢液，危廢處理成本高，環(huán)境與安全管理壓力大。
S/D處理方法改進(jìn)
為解決傳統(tǒng)的S/D處理方式的缺陷，文獻(xiàn)Viral inactivation for pH-sensitive antibody formats such as multi-specific antibodies 提出了一種改進(jìn)的S/D處理方法，即在親和柱上進(jìn)行孵育。經(jīng)過(guò)一系列的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，包括不同下游單元操作對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中S/D的清除效果、S/D孵育步驟在蛋白A親和層析中不同位置的評(píng)估、病毒滅活能力的評(píng)估以及S/D柱上孵育對(duì)蛋白A親和填料壽命的影響，在不新增單元操作的前提下，實(shí)現(xiàn)了病毒滅活、有機(jī)溶劑去除與產(chǎn)物純化的協(xié)同優(yōu)化。
? PA親和層析中不同位置的評(píng)估
TnBP作為一種具有較高毒性的化合物，目前尚未有明確的每日允許暴露量(PDE)標(biāo)準(zhǔn)。然而，若能將TnBP的濃度降至痕量水平，即不超過(guò)1 μg/mL，便可以認(rèn)為其去除是有效的。這一目標(biāo)相當(dāng)于需要實(shí)現(xiàn)至少3.5 log10的去除效率。
文獻(xiàn)中的研究方法即將0.3% w/w的TnBP和1.0% w/w的PS80的S/D溶液加入澄清后的細(xì)胞收獲液中，評(píng)估蛋白A親和層析（PA）、陽(yáng)離子交換層析（CEX）、陰離子交換層析（AEX）以及超濾/滲濾（UF/DF）等下游單元操作對(duì)TnBP的清除能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果（Fig.1 ）顯示，PA步驟可有效去除TnBP（即≥3.48 log10），而其他步驟的清除效率較低（均＜2 log10）。與TnBP相比，PS 80在多個(gè)工藝步驟（如PA和CEX）中均能被有效去除（＜0.0025%（w/w））。
Fig.1 不同下游純化步驟（PA、CEX、AEX和UF/DF）對(duì)TnBP的去除率（TnBP水平通過(guò)GC-MS方法測(cè)定）
盡管CEX、AEX和UF/DF工藝步驟累積可實(shí)現(xiàn)有效去除TnBP（即1.05 log 10 + 1.13 log 10 + 1.78 log 10 = 3.96 log 10），如果在PA步驟之后進(jìn)行S/D病毒滅活，在缺少PA步驟去除TnBP的情況下，該工藝對(duì)TnBP去除的穩(wěn)健性將變差。這可能是眾多生物制藥平臺(tái)選擇在PA前對(duì)澄清的細(xì)胞收獲液進(jìn)行S/D處理以滅活病毒的原因之一。
盡早在PA中去除引入的TnBP不僅可以有效降低TnBP的濃度，避免其潛在毒性，還可以減少產(chǎn)品與TnBP長(zhǎng)時(shí)間接觸的可能性，從而保障最終產(chǎn)品質(zhì)量。
? S/D孵育步驟在蛋白A親和層析中不同位置的評(píng)估
上述研究結(jié)果顯示，對(duì)澄清的細(xì)胞收獲液進(jìn)行S/D處理既能保證病毒滅活的效果，又可兼顧TnBP的有效去除，但是它需要消耗大量的S/D溶液，并可能導(dǎo)致有毒廢水處理成本的增加。為了解決這些問(wèn)題，該文獻(xiàn)中又進(jìn)行了在蛋白A親和層析柱中不同位置進(jìn)行S/D孵育的效果的研究。研究方案如Fig.2 所示：
Fig.2 S/D孵育在Pro A層析中的位置
(A) 在CCCF中，(B) 在樣品上樣之后，第一次淋洗步驟之前，(C) 在第一次淋洗步驟之后
三種方案的研究結(jié)果見(jiàn)Table 1：
Table 1. 三種方案的實(shí)驗(yàn)結(jié)果（工藝性能和產(chǎn)品質(zhì)量）
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這三種方案在蛋白A親和層析洗脫液的質(zhì)量參數(shù)上基本一致。然而，方案C在洗脫液中檢測(cè)到了TnBP的存在，而方案A和B中的TnBP濃度均低于檢測(cè)限。因此，在澄清的細(xì)胞收獲液中進(jìn)行S/D孵育或在蛋白A親和層析上樣之后，第一步wash之前進(jìn)行S/D孵育是更為合理的選擇，因?yàn)樗鼈兡軌蛴行У厝コ齌nBP，同時(shí)保持產(chǎn)品質(zhì)量的一致性。
? 病毒滅活能力的評(píng)估
在評(píng)估蛋白A親和層析上進(jìn)行S/D孵育的病毒滅活效果時(shí)，模型病毒的選擇也至關(guān)重要，由于實(shí)驗(yàn)中使用的抗體由CHO細(xì)胞表達(dá)生成，因此選擇鼠白血病病毒（XMuLV）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。除此之外，需要考慮蛋白A親和層析本身的病毒清除能力。為了獨(dú)立評(píng)估S/D孵育的病毒滅活作用，本研究采用實(shí)驗(yàn)方案方案（ Fig.3 ）即用PBS pH 7.4對(duì)PA填料進(jìn)行平衡（A）、上樣（B），在S/D溶液（ PBS pH 7.4, 0.3% (w/w) TnBP, 1.0% (w/w) PS80）淋洗（C）結(jié)束之后，拆柱并回收散裝填料（D），向填料中引入5% v/v的XMuLV病毒母液，并在不同的時(shí)間點(diǎn)（0-1，15，30，60min）進(jìn)行孵育（E），通過(guò)檢測(cè)TCID50來(lái)評(píng)估病毒的滅活效果（F）。
Fig.3 獨(dú)立評(píng)估S/D孵育的病毒滅活作用實(shí)驗(yàn)方法
Fig.4展示了柱上S/D孵育病毒滅活的指數(shù)趨勢(shì)。S/D孵育60min之后，病毒滴度總降低值為5.41 log 10，實(shí)現(xiàn)了有效的病毒滅活（LRV＞4 log10）。
Fig.4 Pro A親和柱上S/D孵育對(duì)XMuLV的log10清除值 (LRV) 動(dòng)力學(xué)曲線，病毒滅活條件為15-17℃滅活0-1, 15, 30和60 min，實(shí)線代表指數(shù)回歸線，虛線代表95%置信區(qū)間 (CI)
? S/D柱上孵育對(duì)蛋白A親和填料壽命的影響
為評(píng)估S/D柱上孵育對(duì)蛋白A親和填料性能以及最終產(chǎn)品質(zhì)量的影響，文獻(xiàn)中共進(jìn)行了60次S/D孵育的蛋白A親和層析實(shí)驗(yàn)，通過(guò)對(duì)工藝性能屬性和蛋白A親和層析后產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)測(cè)（Table 2），并在第20、40和60次運(yùn)行時(shí)測(cè)定了動(dòng)態(tài)結(jié)合載量（DBC）（Fig.5）來(lái)評(píng)估填料的壽命。
Table 2. 質(zhì)量屬性監(jiān)控結(jié)果
Table 2. 中的數(shù)據(jù)表明，隨著運(yùn)行次數(shù)增加，TnBP的去除效率、洗脫蛋白的SEC純度和CE-SDS純度結(jié)果仍能保持穩(wěn)定的狀態(tài)。
Fig.5 (A) 不同運(yùn)行次數(shù)時(shí)的DBC曲線, (B) 上樣至10%穿透時(shí)計(jì)算的填料載量與運(yùn)行次數(shù)的函數(shù)
Fig.5 結(jié)果顯示，隨著S/D孵育次數(shù)的累積，蛋白A親和填料的10%DBC呈現(xiàn)出遞減的趨勢(shì)（從初始的34 g/L下降至第60次運(yùn)行時(shí)的28 g/L）。結(jié)合Table 2的數(shù)據(jù)，可以看出，10%DBC下降可能影響收率，對(duì)產(chǎn)品質(zhì)量影響不大。
總結(jié)
隨著越來(lái)越多復(fù)雜抗體分子進(jìn)入開(kāi)發(fā)階段，病毒滅活工藝也需要從傳統(tǒng)平臺(tái)化模式向更加產(chǎn)品導(dǎo)向的設(shè)計(jì)思路轉(zhuǎn)變。柱上S/D孵育技術(shù)在保證病毒清除能力的同時(shí)兼顧了產(chǎn)品質(zhì)量和工藝可實(shí)施性，為未來(lái)相關(guān)產(chǎn)品的工藝開(kāi)發(fā)提供了新的參考。
參考文獻(xiàn)
[1]Duret A, et al. Viral inactivation for pH-sensitive antibody formats such as multi-specific antibodies. Journal of Biotechnology, 2024.