編者按
自閉癥譜系障礙（ASD）是一種復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育綜合征，其核心表現(xiàn)為社交溝通障礙、重復(fù)刻板行為和狹隘興趣。研究表明，其成因涉及遺傳因素（如基因突變）、孕期環(huán)境（如感染、毒素暴露）及菌-腸-腦軸功能紊亂等。
今天，我們分享2025年4月29日發(fā)表在Scientific Reports上的題為“Seizure-like behavior and hyperactivity in napb knockout zebrafish as a model for autism and epilepsy”的最新研究成果。該研究利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建了斑馬魚自閉癥及癲癇模型，確定了NAPB基因是自閉癥及癲癇的潛在危險(xiǎn)基因。
研究發(fā)現(xiàn)，敲除NAPB基因的斑馬魚運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度縮短，并表現(xiàn)出過(guò)度活躍的行為異常，如總移動(dòng)距離、游泳速度、旋轉(zhuǎn)頻率增加等，有效模擬了人類癲癇表型。通過(guò)結(jié)合行為學(xué)測(cè)試、電生理MEA分析表明，該斑馬魚模型可用于研究自閉癥譜系障礙（ASD）和癲癇的病理生理機(jī)制，并為相關(guān)疾病的藥物篩選提供了新工具。
文章題目
Seizure-like behavior and hyperactivity in napb knockout zebrafish as a model for autism and epilepsy
雜志：Scientific Reports（Nature子刊）
發(fā)表時(shí)間：2025年4月29日
作者：Kyung Chul Shin, Sahar I. Da’as & Yongsoo Park等
單位：卡塔爾哈馬德·本·哈利法大學(xué)（Hamad Bin Khalifa University, HBKU），卡塔爾生物醫(yī)學(xué)研究所等
01、研究亮點(diǎn)
利用基因編輯技術(shù)構(gòu)建了敲除NAPB基因的斑馬魚自閉癥及癲癇模型，發(fā)現(xiàn)NAPB功能缺失導(dǎo)致斑馬魚運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育異常及癲癇樣行為；
• 結(jié)合行為學(xué)、電生理學(xué)（MEA）和分子生物學(xué)技術(shù)，全面解析了癲癇表型的神經(jīng)機(jī)制，揭示了NAPB敲除通過(guò)增強(qiáng)大腦區(qū)域神經(jīng)興奮性，而非突觸傳遞缺陷，誘發(fā)癲癇表型；
• NAPB基因敲除的斑馬魚成功模擬了ASD和癲癇的共病表型，如過(guò)度活躍、神經(jīng)超興奮性等，為病理機(jī)制研究提供了新工具，也可用于高通量篩選靶向神經(jīng)超興奮性的抗癲癇藥物。
02、研究背景
自閉癥譜系障礙（ASD）是一種復(fù)雜的神經(jīng)發(fā)育綜合征，主要表現(xiàn)為重復(fù)性行為和社交溝通障礙等。共病現(xiàn)象在ASD患者身上十分普遍，且常伴隨多個(gè)，其中癲癇是常見癥狀之一。我們的研究已證實(shí)，NAPB（N-乙基馬來(lái)酰亞胺敏感因子附著蛋白β）是ASD的潛在風(fēng)險(xiǎn)基因。一組卡塔爾ASD三胞胎患者被發(fā)現(xiàn)基因雜合突變，其從父母遺傳的NAPB純合基因變異，以致于這三個(gè)男孩均表現(xiàn)出不同程度的早期癲癇性腦病，且病情程度和藥物反應(yīng)各異。
基于此，研究人員構(gòu)建了患者特異性、父母特異性及經(jīng)過(guò)基因修正的NAPB多能干細(xì)胞系，這些干細(xì)胞分化的人類神經(jīng)元顯示，患者神經(jīng)元中NAPB功能缺失。此外，兩項(xiàng)國(guó)際獨(dú)立研究也發(fā)現(xiàn)了兩種與癲癇相關(guān)的NAPB功能缺失突變，進(jìn)一步證實(shí)了NAPB突變?cè)贏SD和癲癇中的關(guān)鍵作用。
NAP，又稱可溶性NSF附著蛋白（SNAP），是NSF ATP酶的重要輔助因子，可促進(jìn)SNARE復(fù)合體的解聚，從而釋放游離SNARE蛋白以用于后續(xù)膜融合反應(yīng)。NAP-α（NAPA）與NAP-β（NAPB）的序列相似性達(dá)83%，分子量分別為33 kDa和34kDa。NAPB在大腦中特異性表達(dá)，而NAPA則廣泛分布于多種組織。與NAPB基因突變患者的癲癇表型一致，NAPB基因敲除（KO）后的小鼠在出生后表現(xiàn)出嚴(yán)重的復(fù)發(fā)性癲癇。然而，NAPB基因缺失并不影響細(xì)胞水平的突觸傳遞和短期可塑性。同樣，在NAPB基因突變的多能干細(xì)胞分化的人源皮質(zhì)神經(jīng)元中，也未觀察到神經(jīng)元活動(dòng)及鈣內(nèi)流缺陷，這表明細(xì)胞模型可能無(wú)法充分模擬癲癇表型。開發(fā)NAPB基因突變的動(dòng)物模型，對(duì)研究ASD和癲癇病理機(jī)制仍然具有挑戰(zhàn)性。
斑馬魚，因其與人類的遺傳相似性高、通體透明、明確的中樞神經(jīng)系統(tǒng)等，被廣泛用于癲癇和神經(jīng)發(fā)育障礙研究。斑馬魚的可量化行為，可有效模擬癲癇發(fā)作、多動(dòng)和其他神經(jīng)發(fā)育異常等，為相關(guān)疾病建模提供了理想平臺(tái)。本研究利用基因編輯技術(shù)，對(duì)兩種NAPB直系同源基因——napba、napbb，構(gòu)建了NAPB斑馬魚模型，以探究NAPB基因相關(guān)的癲癇病理機(jī)制。
本研究通過(guò)構(gòu)建敲除NAPB基因的斑馬魚，探究其癲癇樣表型及NAPB基因遺傳變異相關(guān)的神經(jīng)病理特征，并結(jié)合行為學(xué)測(cè)試、MEA電生理功能分析，研究癲癇及相關(guān)神經(jīng)疾病的病理生理機(jī)制，揭示NAPB突變?nèi)绾瓮ㄟ^(guò)神經(jīng)超興奮性誘發(fā)疾病表型。
03、研究結(jié)果
1. 斑馬魚模型探究NAPB基因突變與癲癇的關(guān)聯(lián)
通過(guò)對(duì)卡塔爾100多個(gè)自閉癥家庭進(jìn)行全外顯子組基因測(cè)序，證實(shí)NAPB基因是自閉癥譜系障礙（ASD）和其他神經(jīng)發(fā)育障礙的潛在風(fēng)險(xiǎn)基因。
研究人員通過(guò)基因編輯技術(shù)，敲除兩個(gè)napb直系同源基因，構(gòu)建了NAPB基因敲除斑馬魚（CR），并通過(guò)活體成像發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，NAPB基因敲除的斑馬魚運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突長(zhǎng)度顯著縮短（圖1A-B），表明神經(jīng)發(fā)育與連接異常可能引起疾病發(fā)生，但神經(jīng)肌肉突觸在軸突分支模式上與對(duì)照組無(wú)明顯差異，表明NAPB缺失可能不直接影響突觸結(jié)構(gòu)。
在斑馬魚癲癇模型中，NAPB基因敲除的斑馬魚總移動(dòng)距離、游泳速度、旋轉(zhuǎn)頻率等均顯著升高（圖1C-E），其行為學(xué)變化有效模擬了人類癲癇表型，表明該模型可用于ASD相關(guān)癲癇的病理機(jī)制研究。
圖1
2. PTZ誘導(dǎo)斑馬魚癲癇樣活動(dòng)，但在NAPB敲除的斑馬魚中效果減弱
戊四氮（PTZ）是γ氨基丁酸(GABA-A)及其受體復(fù)合物的抑制劑，可用于誘發(fā)癲癇、驚厥等。通過(guò)降低GABAA的抑制性效應(yīng)，從而增強(qiáng)神經(jīng)元興奮性并誘導(dǎo)斑馬魚癲癇樣行為，其常可用于誘導(dǎo)過(guò)度活躍及癲癇樣運(yùn)動(dòng)表型。
研究人員通過(guò)定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（qPCR）分析，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組的斑馬魚表現(xiàn)出顯著的行為異常，如總移動(dòng)距離（圖1F）、游泳速度（圖1G）及旋轉(zhuǎn)頻率（圖1H）均顯著增加，且PTZ處理期間，斑馬魚的行為異常呈持續(xù)性。
進(jìn)一步探究PTZ對(duì)NAPB敲除的斑馬魚的作用，結(jié)果顯示，在PTZ暴露的前8分鐘，NAPB敲除的斑馬魚總移動(dòng)距離、游泳速度及旋轉(zhuǎn)頻率均顯著高于對(duì)照組；但隨著時(shí)間的推移，PTZ的效應(yīng)逐漸減弱，這可能與后續(xù)出現(xiàn)的活動(dòng)停滯期有關(guān)。
3. NAPB敲除的斑馬魚神經(jīng)超活躍與超興奮性
隨后，研究人員利用微電極陣列（MEA）技術(shù)來(lái)研究斑馬魚的神經(jīng)活動(dòng)及神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的形成。在對(duì)照組斑馬魚中，大腦神經(jīng)活動(dòng)（紅色信號(hào)）與脊髓活動(dòng)高度同步（圖2C），表明其神經(jīng)系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)連接完整，大腦激活可觸發(fā)脊髓及運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的協(xié)同放電。相比之下，NAPB敲除的斑馬魚表現(xiàn)出顯著的腦區(qū)神經(jīng)超活躍（圖2D-F），且腦區(qū)異常活躍的個(gè)體數(shù)量顯著高于對(duì)照組（圖2G）。因此，NAPB敲除的斑馬魚腦部神經(jīng)超活躍與其癲癇樣行為（圖1C-E）直接相關(guān)，證實(shí)了該模型的癲癇表型。
圖2
此外，由于NAPB敲除的斑馬魚已處于高神經(jīng)興奮狀態(tài)，在PTZ誘導(dǎo)的癲癇模型中，其超活躍性有所降低，這與NAPB模型先前觀察到的癲癇樣行為表型一致。
圖3
04、編者點(diǎn)評(píng)
本研究構(gòu)建了NAPB敲除的斑馬魚自閉癥及癲癇模型，揭示了NAPB功能缺失導(dǎo)致斑馬魚運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育異常和癲癇樣行為，并發(fā)現(xiàn)NAPB基因敲除通過(guò)增強(qiáng)大腦區(qū)域神經(jīng)興奮性，而非突觸傳遞缺陷，誘發(fā)癲癇表型，為研究ASD和癲癇的病理機(jī)制及藥物篩選提供了新工具。
作為健康美麗產(chǎn)業(yè)CRO服務(wù)開拓者與引領(lǐng)者、斑馬魚生物技術(shù)的全球領(lǐng)導(dǎo)者，環(huán)特生物搭建了“斑馬魚、類器官、哺乳動(dòng)物、人體”多維生物技術(shù)服務(wù)體系，開展健康美麗CRO服務(wù)、科研服務(wù)、智慧實(shí)驗(yàn)室搭建三大業(yè)務(wù)。目前，環(huán)特已建立200多種斑馬魚模型，胃癌、腦類器官、心臟類器官及各種腫瘤類器官培養(yǎng)平臺(tái)，歡迎有需要的讀者垂詢！