多巴胺(dopamine, DA)神經元在黑質致密部(substantia nigra pars compacta, SNpc)的死亡是帕金森病(Parkinson’s disease, PD)的一個病理性標志^[1,2]。PD的病理表現包括運動缺陷，運動遲緩和靜息性震顫等，目前還沒有減緩帕金森病的有效手段。其中α-Synuclein (α-Syn)和線粒體功能障礙是引起PD的已知誘因^[3-4]。

NLRP3炎癥小體是先天免疫系統的主要組成部分，其是由細胞質模式識別受體NLRP3、銜接蛋白ASC和Caspase-1 (Casp1)組成的三蛋白復合體。致病性感染和無菌炎癥都會觸發該復合物的組裝^[5]。其中NLRP3炎癥小體需要“啟動和激活”兩個信號完成組裝。啟動過程中會形成NLRP3蛋白，激活過程中線粒體產生ROS，并在寡聚過程中形成接頭蛋白ASC和蛋白酶Casp1^[4]。有研究表明，小膠質細胞NLRP3炎癥小體過度激活導致無菌炎癥反應有助于PD病理^[6]。但神經元炎癥小體激活在神經退行性疾病中的作用尚不清楚。

近日，美國Johns Hopkins大學Ted M. Dawson實驗室在Neuron發表了題為Neuronal NLRP3 is a parkin substrate that drives neurodegeneration in Parkinson’s disease的文章，闡明了抑制神經元中NLRP3炎癥小體激活對PD治療的有效性^[7]。

首先，研究者們將AAV GFP-Cre立體定向注射到成年parkinflx/flx小鼠的SNpc區（圖1A），引起線粒體功能和質量下降，進而引起DA神經元死亡。通過免疫蛋白印跡分析發現，AAV GFP-Cre組小鼠腦內NLRP3和Casp1上調（圖1B），這提示NLRP3炎癥小體被激活。研究者們進一步通過免疫熒光染色的結果發現FLICA（標記ASC蛋白）和TH共標，這說明AAV GFP-Cre組炎癥小體的激活發生在DA神經元內，而小膠質細胞中炎癥小體激活并無差異。

圖1: 敲除DA神經元parkin引起自身NLRP3炎癥小體激活

為了進一步探究神經元NLRP3激活的作用，研究者們以Cre依賴的NLRP3基因突變小鼠：Nlrp3A350VneoR為實驗對象（Cre存在時NLRP3基因會持續激活），分別向8-10周齡的Nlrp3A350VneoR小鼠SNpc區注射了AAV-GFP和AAV-GFP-Cre，并在三個月后對組織進行取材和組織學檢查（圖2A）。免疫組化的結果顯示：SNpc區TH+神經NLRP明顯激活，并且引起了炎癥反應（圖2B-D）。而且研究者們在注射AAV-GFP-Cre的一側觀察到了大量的DA神經元死亡（圖2E-F）。這說明NLRP3炎癥小體的激活會引起DA神經元死亡。

圖2:NLRP3激活可引起DA神經元死亡

先前有研究表明在parkin缺失的情況下PARIS可抑制線粒體的形成進而引起線粒體缺失^[8-9]，由于線粒體功能異常會引起NLRP3炎癥小體激活，研究者們接下來探究了PARIS在DA神經元炎癥反應中的作用。研究者們分別將AAV shRNA-PARIS（或 AAV con-shRNA）與AAV GFP-Cre一起注射到成年parkinflx/flx小鼠的SNpc區，從而抑制敲低DA神經元的parkin后PARIS的反應（圖3A）。研究結果顯示，在敲除parkin后，敲低PARIS會抑制Casp1的上調，但NLRP3的水平不受影響（圖3C），這提示PARIS可能參與了DA神經元NLRP3炎癥小體激活的“激活”階段但不參與“啟動”階段。

為了進一步確定NLRP3的作用，研究者們分別將AAV NLRP3-shRNA（或 AAV con-shRNA）和AAV GFP-Cre一起注射到成年parkinflx/flx小鼠的SNpc區從而抑制parkin敲除后NLRP3的反應。研究結果顯示在敲除NLRP3后Casp1的激活完全消失了（圖4A），并且AAV NLRP3-shRNA組DA神經元的數量相較于AAV con-shRNA組顯著增加（圖4B-C），這說明抑制NLRP3可避免parkin缺失時DA神經元的死亡。

研究者們也通過類似的方式探究了Casp1在parkin缺失時的作用。他們將parkinflx/flx小鼠分別和Casp1+/+小鼠以及Casp1-/-小鼠合籠，并向其后代成年小鼠的SNpc區定向注射AAV GFP和AAV GFP-Cre敲除parkin，并在三個月對小鼠進行組織學檢測。研究結果顯示敲除parkin缺失小鼠的Casp1同樣可以避免DA神經元的死亡（圖4D、E）。

圖4:抑制NLRP3或Casp1都可避免parkin缺失小鼠DA神經元的死亡

此外，研究者們還對人類PD患者的腦組織進行了組織學檢驗，研究結果顯示PD患者腦內NLRP3、Casp1、PARIS的水平都顯著高于對照組（圖5A）。并且研究者們在PD患者多巴胺神經元中觀察到了明顯的NLRP3和ASC水平上調（圖5B、C、D），這進一步證實了在人類PD患者腦內的確存在DA神經元炎癥小體激活的現象。

總之，這項工作闡明了DA神經元中NLRP3炎癥小體激活導致DA神經元死亡的機制，并提出了抑制NLRP3和Casp1可避免DA神經元死亡的現象，也為PD治療提供了一個新的疾病治療靶點。

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參考文獻…

[1] Dauer, W., and Przedborski, S. (2003). Parkinson’s disease. Neuron 39,889–909.

[2] Pirooznia, S.K., Rosenthal, L.S., Dawson, V.L., and Dawson, T.M. (2021). Parkinson disease: translating insights from molecular mechanisms to neuroprotection. Pharmacol. Rev. 73, 1204–1268.

[3] Di Maio, R., Barrett, P.J., Hoffman, E.K., Barrett, C.W., Zharikov, A., Borah, A.,Hu, X., McCoy, J., Chu, C.T., Burton, E.A., et al. (2016). a-Synuclein binds to TOM20 and inhibits mitochondrial protein import in Parkinson’s disease. Sci.Transl. Med. 8, 342ra378.