Hieff Clone^TM實驗流程：
? ? Hieff Clone^TM一步法同源重組快速定向克隆試劑盒分為單片段克隆和多片段克隆試劑盒，實驗流程見下圖1。


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圖1：Hieff Clone^TM一步法快速定向克隆試劑盒進行單片段和多片段克隆實驗流程圖。

①線性化載體的制備：酶切或PCR制備線性化載體。②插入片段的制備：在目的DNA片段上下游引物的5’端引入20 bp左右末端同源序列；PCR反應擴增目的片段。③重組反應：按比例混合線性化載體和目的DNA片段進行重組，50℃反應20 min。④轉化、涂板：將重組產物直接轉化后涂平板。挑取克隆。

產品實例：
1.單片段高效重組克隆

圖2：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit可以有效克隆不同長度的單片段基因。A-D：重組轉化平板。E：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。F-H：插入片段PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體：pFastBac1，4.7 kb，插入片段大小分別是1.2 kb，3 kb和5 kb，載體量：100 ng/20 μl反應體系，載體與插入片段摩爾比：1:3，反應條件：50℃，20 min。

2. 多片段輕松重組克隆

圖3：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit進行三片段克隆。A：重組轉化平板。B：插入片段和載體濃度檢測電泳圖。C：PCR方法鑒定每個單片段和最終連接基因。箭頭指示目的條帶。載體：pCAMIBA1302，10 kb，三個插入片段長度：1 kb，1.5 kb和2.5 kb，載體量：160 ng/20 μl反應體系，重組反應條件50℃，20 min。

3. 載體與插入片段摩爾比1:3左右最適

圖4：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit試劑盒單片段和載體不同摩爾濃度比例重組克隆測試。A-C：重組轉化平板。載體與插入片段的分子摩爾數比分別是1:2（A），1:3（B）和1:4（C），重組反應條件50℃，20 min。

4. 重組反應時間20-30 min最佳
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圖5：Hieff Clone^TM One Step Cloning Kit試劑盒不同重組反應時間克隆測試。A-C：重組轉化平板。重組反應時間分別是20 min（A），25 min（B）和30 min（C），重組反應溫度50℃。

客戶案例展示：
1.超高的陽性率

客戶單位：中國科學院植物生理生態研究所
圖6：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit進行克隆，陽性率100%。A：重組轉化平板。B：克隆基因PCR鑒定電泳圖。載體：10 kb，插入片段：300 bp，載體濃度：50 ng/μl，插入片段濃度：50 ng/μl，載體與插入片段摩爾比例為1:1，重組反應條件50℃，20 min。

2.低濃度載體重組

客戶單位：西南大學
圖7：使用Hieff Clone^TM Plus One Step Cloning Kit進行克隆。A：重組轉化平板。B：載體濃度檢測電泳圖。C：插入片段濃度檢測電泳圖。D：克隆基因PCR鑒定電泳圖。箭頭指示目的條帶。載體4.7 kb，插入片段1.6 kb，載體濃度：5 ng/μl，插入片段濃度：25 ng/μl，載體與插入片段摩爾比例為1:2，重組反應條件50℃，20 min。

3。超高性價比

圖8：Hieff Clone^TM Plus Multi One Step Cloning Kit與不同品牌的同類產品相比，顯示出更高的性價比。

FAQ

Q1：Hieff Clone^TM克隆的原理是什么？

A1： 利用末端同源重組的原理。將任意線性化載體和具有與其兩端20 bp左右同源序列的DNA片段快速定向克隆。

Q2：與傳統克隆相比，Hieff Clone^TM克隆有什么優勢？

A2：1）無需考慮酶切位點：不受目的DNA片段限制性酶切位點的限制，適用于任何載體。

2）設計簡單：在目的片段的PCR擴增引物5’端引入20 bp左右與載體末端同源的序列即可。

3）快速高效：50℃，20 min即可完成重組反應?？寺￡栃月士蛇_95%以上。

4）無縫克?。翰迦胛稽c不會引入額外的堿基序列。

Q3：同源序列長度對重組效率的影響？

A3：同源序列的長度與克隆數目有相關性，一般同源片段選擇在20 bp左右，可以在15 bp-25 bp范圍內調整。并且選擇盡量避免出現二級結構。

Q4：線性化載體和目的片段產物的質量會影響重組反應嗎？

A4：線性化載體或目的片段品質較差時會極大影響重組反應，建議割膠回收純化產物。

Q5：一步法快速定向克隆試劑盒對感受態細胞有要求嗎？

A5：推薦使用轉化效率為10⁸ cfu/μg的感受態細胞。如Yeasen的DH5α（cat NO. 11802ES），TOP10（cat NO. 11801ES）等。

Q6：線性化載體和目的片段擴增產物的使用量和比例？

A6：載體使用量應大于0.01 pmol，推薦使用量0.03 pmol；克隆載體與目的片段摩爾比應在2:1-1:5范圍內，最適為1:2-1:3，超過范圍可能會影響克隆效率。

Q7：一步法快速定向克隆試劑盒適用實驗有哪些？

A7：本試劑盒適用于絕大多數基于常規“酶切-連接”方法的克隆實驗，并且特別適用于其它常規方法難以快速實現的基因多點突變、全基因合成等。

Q8：多片段一步法快速定向克隆試劑盒可以用于單片段的克隆嗎？

A8：多片段一步法克隆試劑盒可以用于單片段的克隆。但是，單片段克隆試劑盒不建議用于多片段的克隆，重組效率可能會受到影響。

Q9：一步法快速定向克隆試劑盒反應溫度是50℃，是否可以在37℃進行反應？

A9：一般情況下建議在50℃進行反應。50℃