骨髓細胞染色體制備???
?骨髓染色體標本制備通常用于白血病患者，特別是慢性或急性粒細胞性白血病，因為骨髓反映粒系統細胞增生情況，這些病人不宜用外周血。即使是淋巴細胞性白血病，也不主張用外周血，因為加PHA刺激外周血培養，只能獲得正常淋巴細胞分裂相，并不能反映那些病理淋巴細胞的染色體改變。骨髓細胞屬不斷增殖的細胞，培養可分短期培養和直接制片法，無論哪種其培養液中均不需加PHA。
一、直接法
（一）試劑準備
1．PH7.4的PBS或0.9%的生理鹽水20ml。
2．0.2%肝素。
3．0.0005%秋水仙酰胺溶液。
4．0.075mol/L KCL溶液
5．3:1甲醇、冰醋酸溶液。
6．10%Giemsa染色液。
（二）操作程序
1．標本采集。用肝素濕潤的針筒抽取骨髓2ml或更多，立即注入含1640培養基的標本瓶中。
2．細胞接種。將標本瓶帶回實驗室后，先做骨髓有核細胞計數，再按8×106/ml的細胞密度注入標本瓶中，然后補充PH為7.4的PBS或0.9%NS至20ml。
3．阻留中期分裂相。立即加入秋水仙酰胺，終濃度為0.05μg/ml，搖勻后置37℃溫箱中1h。
4．收獲細胞。將培養物吸至尖底離心管，離心，1000轉/min，10min。
5．低滲。棄上清液，沿管壁緩緩加入預溫37℃的0.075mol/L KCL溶液6～8ml，吹打混勻后置37℃溫箱30min。
6．預固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混勻。
7．離心。1000轉/min,10min。
8．固定。吸去上清液，加新鮮配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6～8ml，吹打混勻。
9.離心。1000轉/min，10min。
10．重復9、10步驟兩遍，使細胞經過3次固定，除第一次固定至少30min外，其余兩次固定，每次15min或30min均可。
11．細胞懸液的制備和保存。吸去上清液，加入適量固定液，制成濃度合適的細胞懸液。此液置-20℃冰箱中可保存1至數年。在此期間可隨時取出，供各種顯帶處理或FISH檢測之用。
12．制片。用吸管將細胞懸液輕輕打勻后吸取少量，從10cm高處滴至一端傾斜15o的經冰水或20%乙醇浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴2～3滴，然后在酒精燈上焰上來回通過數次，使其干燥。
13．染色。標本采用10% Giemsa染色液染色20～30min，流水沖洗，待干，鏡檢。剩余標本置4℃冰箱或-20℃冰箱備做各種顯帶之用。
（三）注意事項
1．骨髓直接法應在標本采集后1h內進行，超過此時間則細胞活力下降而致分裂相少見。
2．骨髓直接法的效果好壞與細胞接種關系不大，因此若不準備進行培養者，骨髓抽吸后可立即注入20ml生理鹽水中，而不需要作骨髓有核細胞計數。
3．骨髓細胞染色體制備和外周血染色體制備最主要的不同在于：①秋水仙酰胺終濃度和處理時間：前者0.05μg/ml×1h，后者0.1μg/ml×2～4h；②低滲時間；前者30min，后者15min。
二、短期培養法
（一）試劑準備
1．培養基的配制和保存。同外周血染色體制備[第二部分第五章一]。
（二）操作程序
1．細胞接種。將標本瓶帶回實驗室后，先做骨髓有核細胞計數，再按1～3×106/ml的細胞密度注入標本瓶中，然后補充PH為7.4的PBS或0.9%NS至20ml。
2．細胞培養。將培養瓶放入37℃溫箱中持續培養24或48h，其間定時搖勻培養物。
3．阻留中期分裂相。于終止培養前2-4h加入秋水仙酰胺，終濃度為0.1μg/ml。
4．收獲細胞。將培養物吸至尖底離心管，離心，1000轉/min，10min。
5．低滲。吸去上清液，加入預溫至37℃的0.075mol/L KCL溶液6～8ml，用吸管吹打混勻后置37℃溫箱15min。
6．預固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混勻。
7．離心。1000轉/min,10min。
8．固定。吸去上清液，加新鮮配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6～8ml，吹打混勻。
9.離心。1000轉/min，10min。
10．重復9、10步驟兩遍，使細胞經過3次固定，除第一次固定至少30min外，其余兩次固定，每次15min或30min均可。
11．細胞懸液的制備和保存。吸去上清液，加入適量固定液，制成濃度合適的細胞懸液。此液置-20℃冰箱中可保存1至數年。在此期間可隨時取出，供各種顯帶處理或FISH檢測之用。
12．制片。用吸管將細胞懸液輕輕打勻后吸取少量，從10cm高處滴至一端傾斜15o的經冰水或20%乙醇浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴2～3滴，然后在酒精燈上焰上來回通過數次，使其干燥。
13．染色。標本采用10% Giemsa染色液染色20～30min，流水沖洗，待干，鏡檢。剩余標本置4℃冰箱或-20℃冰箱備做各種顯帶之用。
（三）注意事項
1．細胞密度以1～2×106/ml左右為宜。
2．遠距離運送的標本必須在24h內投入培養。
3． 改良方法有以下兩種，可任擇其一：①收獲細胞前6h加入10-5mol/L的胸腺嘧啶核苷（Tdr），秋水仙酰胺處理時間縮短為10～30min；②收獲細胞前2h加入終濃度為10μg/ml的溴乙錠，秋水仙酰胺處理時間不變。