外周血染色體制備

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一、試劑準備

1．培養液

2．0.2%肝素溶液

3．0.0005%秋水仙酰胺溶液（黑紙包裹避光置4℃冰箱保存）

4．0.075mol/L氯化鉀溶液

5．3:1甲醇、冰醋酸固定液（臨用前配制）

6．10%Giemsa染色液

7．2%PHA溶液

二、操作程序

1．標本采集。用肝素潤濕的針筒采靜脈血1ml，混勻后注入兩瓶含5ml培養液的標本瓶中，每瓶0.3～0.5ml。

2．加PHA。每瓶培養液加入PHA溶液0.2ml。

3．培養。標本混勻后置37℃溫箱培養72h，每日早晚定時搖勻培養物1次。

4．阻留中期分裂相。于終止培養前2-4h加入秋水仙酰胺，終濃度為0.1μg/ml。

5．收獲細胞。將培養物吸至尖底離心管，離心，1000轉/min，10min。

6．低滲。吸去上清液，加入預溫至37℃的0.075mol/L KCL溶液6～8ml，用吸管吹打混勻后置37℃溫箱15min。

7．預固定。加入3:1甲醇、冰醋酸固定液1ml，吹打混勻。

8．離心。1000轉/min,10min。

9．固定。吸去上清液，加新鮮配制的3:1甲醇、冰醋酸固定液6～8ml，吹打混勻。

10.離心。1000轉/min，10min。

11．重復9、10步驟兩遍，使細胞經過3次固定，除第一次固定至少30min外，其余兩次固定，每次15min或30min均可。

12．細胞懸液的制備和保存。吸去上清液，加入適量固定液，制成濃度合適的細胞懸液。此液置-20℃冰箱中可保存1至數年。在此期間可隨時取出，供各種顯帶處理或FISH檢測之用。

13．制片。用吸管將細胞懸液輕輕打勻后吸取少量，從10cm高處滴至一端傾斜15o的經冰水或20%乙醇浸泡過的潔凈無脂的玻片上，每片滴2～3滴，然后在酒精燈上焰上來回通過數次，使其干燥。

14．染色。標本采用10% Giemsa染色液染色20～30min，流水沖洗，待干，鏡檢。剩余標本置4℃冰箱或-20℃冰箱備做各種顯帶之用。

三、注意事項

1．培養液的PH以7.3±0.1為佳，偏酸則細胞生長不良，偏堿則細胞固縮。

2．溫度應嚴格控制在37±0.5℃。

3．所有試劑均應采用分析純產品和三蒸水配制。

4．所有玻璃器皿要求絕對干凈，無酸。

5．操作程序1～4需注意無菌技術，嚴防細菌和病毒污染。