?掌握這幾個影響因素，你的反轉錄實驗就完美了

小翊君前幾期一直在和大家聊qPCR，今天我們開啟一個新的話題，聊一聊反轉錄。

反轉錄（reverse transcription）定義:

反轉錄過程簡單來說是以RNA為模板合成DNA的過程，是對中心法則的重要修正和補充。

中心法則

通常會出現兩個不同的表述，逆轉錄和反轉錄，二者的本質區別在于：反轉錄是在研究過程中人為提取RNA并以之為模板人工合成DNA的過程。逆轉錄是RNA病毒自主行為，以RNA為模板形成DNA的過程。前者發生在體外，后者發生在體內。反轉錄反應的示意圖如下圖所示：

反轉錄實驗過程

看似簡單的反轉錄實驗，但也受到多種因素的影響，如模板、引物、酶以及反應條件等。接下來小編將帶您對其各個擊破。

一、模板

①?RNA自身結構（高GC、復雜二級結構）

RNA由于自身序列折疊，具有不同復雜的二級結構：配對的雙鏈RNA呈螺旋，發卡環，突環，內環，多分支環等結構。由于配對堿基不同，其配對的穩性也不同，如G與C之間的配對，三對氫鍵，最為穩定。A與U為兩對氫鍵相互作用；G與U為一對氫鍵相互作用，最不穩定。故對于RNA模板來講，GC含量越高，二級結構越為復雜。

在進行反轉錄的過程中，如下圖所示，當引物延伸到有二級結構的地方，反應就會被迫終止，影響cDNA的合成長度。此時可建議先將模板進行65℃孵育5min然后迅速冰上冷卻使二級結構變性；同時可通過在較高的溫度下（如55℃）反應以降低RNA二級結構的形成。

反轉錄實驗延伸過程

②?純度和濃度的測定

RNA純度會很大程度地影響反轉錄實驗，如RNA純化過程中混入的鹽、金屬離子、乙醇、苯酚等均是常見的逆轉錄酶抑制劑。此外植物組織中的多糖多酚和腐殖酸等也會對逆轉錄酶造成抑制作用。

對于RNA純度的測定，通常會選用Nano drop進行測定。純度完好的RNA：1.8＜OD260/OD280＜2.0（＜1.8時表明有蛋白質或酚污染，可增加酚抽提；＞2.0時表明可能有異硫*酸殘存）；OD260/OD230應大于2。（＜2表明有異硫*酸胍，β-巰基乙醇或乙醇的殘留；可進行再次沉淀，重復乙醇洗滌）。

對于RNA濃度的測定，通常也會選用Nano drop進行測定。

③ 完整度

RNA的完整度在很大程度上影響著cDNA合成的長度與質量。在進行RNA提取處理儲存和實驗過程中需要采取特殊的保護措施，如操作者佩戴手套和口罩，全程使用無RNA酶污染的實驗耗材等。

對于下游的克隆實驗，RNA完整度將會影響cDNA的合成長度，從而影響目的基因的合成。對于下游的目的基因定量實驗，將會嚴重影響其CT值，從而影響定量結果精準度（見下圖）。

RNA RIN值和CT值的關系

RNA的完整度通常會通過瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，對于28S和18S rRNA的比值來評估RNA的完整度，接近2:1為較為完整的RNA。

目前，Agilent?2100生物分析儀已逐漸成為RNA樣品質量控制（QC）的行業標準，在分析RNA完整性之后給出準確的數值（RIN值），該值在8-10之間表示RNA質量非常好，小于7時表示RNA完整度較差。

④?gDNA的去除

在進行下游qPCR實驗過程中Totol RNA中混入的gDNA可直接作為PCR反應的模板進行擴增，造成實驗結果的假陽性。因此在反轉錄之前必須要對RNA模板進行去gDNA處理，保證模板中僅有cDNA。

那么如何解決呢？

我們可通過加入DNaseⅠ去除gDNA。但是在反轉錄實驗前需將DNaseⅠ滅活（通過高溫加熱或加入EDTA），否則該酶會將cDNA降解，但是高溫滅活DNaseⅠ會造成RNA的降解和損失，加入EDTA滅活又會引入新的RNA酶抑制劑。

Yeasen生物提供的反轉錄試劑盒含gDNA digester組分，在反轉錄之前可將其與RNA模板混勻42℃，2min即可去除gDNA組分，同時此試劑盒中的SuperMix 可終止gDNA digester的作用，保證cDNA的完整性。

二、引物

①?Oligo(dT)

Oligo(dT)引物是約12-18個多聚胸腺嘧啶T組成的重復寡核苷酸序列，能夠特異性地與真核生物mRNA的ploy(A)尾退火，故不適合缺少ploy(A)尾結構的RNA，如原核生物,?RNA或microRNA，也不適用于已降解的RNA，如FFPE樣品中RNA。

真核生物中mRNA僅占總RNA的1%-5%左右，通常在進行從真核生物中構建cDNA文庫，或者克隆全長cDNA以及3’RACE等研究時會優先選擇 Oligo(dT)引物。

對于復雜模板RNA，如含較多二級結構，在進行cDNA的合成延伸過程中，當延伸到二級結構處時，可能會造成延伸終止，若選擇Oligo(dT)可能會造成mRNA?5’端信息的丟失。

②?Random N6-N9

隨機引物是由隨機堿基組成的寡核苷酸，通常由6個核苷酸組成，稱為隨機6聚體。該種引物不具備特異性，rRNA, tRNA,非編碼RNA，小RNA，降解RNA，復雜二級結構的RNA等都可以作為其模板。該類引物可提高cDNA的產量和濃度，但是會使合成的cDNA長度變短。

③ 基因特異性引物

基因特異性引物能夠與模板特異性互補，產生目標性很強的cDNA，對于后續的PCR擴增更特異，適用于已知目的序列。通常應用于一步RT-PCR反應。當使用基因特異性引物（GSP）無法有效合成第一鏈cDNA時，可選用Oligo(dT)或隨機引物。

三、酶

不同的逆轉錄酶具有不同的功能活性，表現出不同的逆轉錄效率，如合成cDNA的長度，產量，對復雜模板的適應程度等。通常共有的活性如下：

1）RNA指導的DNA聚合酶活性：以RNA為模板，催化dNTP聚合形成DNA的過程。

2）RNaseH活性：在反應過程中切割RNA：cDNA雜合鏈中的RNA模板。降低此活性，可避免在合成較長cDNA之前模板RNA被降解掉。

3）DNA指導的DNA聚合酶活性：以反轉錄合成的第一條cDNA單鏈為模板，再合成第二條cDNA分子。

4）熱穩定性：此性能是影響cDNA合成的重要因素。升高反轉錄過程中的溫度，有助于高GC或復雜二級結構RNA模板的變性，實現全長cDNA的合成。

5）保真性：RNA反轉錄為cDNA過程中的序列精確度。由于逆轉錄酶不具備3’-5’外切酶活性，因此沒有校正功能，所以合成的cDNA出錯率較高。通常，除測序對精準度要求較高外，其他情況下，反轉錄中引入的錯誤數量可忽略不計，因為cDNA中的錯誤不會被放大。

6）抗抑制能力：當模板純度較低、抑制物較多時，抗抑制能力強的逆轉錄酶才能正常進行cDNA的合成。

目前使用的逆轉錄酶大都為MMLV（來源于莫洛尼鼠白血病病毒）。未經改造的MMLV最適反應溫度為37℃，有較低的RNaseH活性。Yeasen生物對MMLV反轉錄酶進行改造，提高其最適反應溫度（高溫下有利于RNA二級結構的打開），降低RNaseH活性，提高cDNA合成長度，增強其靈敏度和耐抑制能力。改造結果見下圖：

逆轉錄酶的改造

各種逆轉錄酶的性能參數如下表：