利用AAV，讓你的心血管系統研究起飛
心血管疾病的研究千千萬萬，我們如何利用心臟特異性的轉基因鼠，和心肌細胞特異性的AAV病毒，發個好文章呢？來來來，跟著小編一起看！
2017年5月16日，在心血管系統著名雜志《Circulation Research》上在線發表了北京大學分子醫學所何愛彬研究組題為“Divergent requirements for EZH1 in heart development versus regeneration”的研究成果。研究揭示了表觀調控因子EZH1在心臟發育和再生過程中，通過產生不同的組蛋白修飾，導致截然不同的分子機制，調控發育與再生兩個關聯的生物學過程，但是最終卻殊途同歸—促進心臟形態與功能的重建與完善。該結果為心臟再生的臨床治療策略提供了新的理論依據。
我們知道，由于成體心肌細胞（CM，cardiomyocyte）在損傷后缺乏有效的再生和自我修復能力，因此如何在心梗等心臟損傷性疾病后，修復和再生心肌細胞就成了極為棘手的醫學問題。
PRC2 (Ploycomb Repressive Complex2) 是一個重要的表觀遺傳修飾酶復合體，它包括兩個互補的催化亞基EZH1和EZH2，能修飾H3K27me3(抑制性組蛋白修飾)的形成從而抑制基因表達，但是其具體的分子機制尚不十分清楚。課題組前期發表的工作表明PRC2在心臟發育過程中起重要表觀調控作用，下面利用心肌特異性基因敲除鼠、腺相關病毒AAV以及RNA-seq的方法，對PRC2的兩個互補的催化亞基EZH1和EZH2的分子機制進行進一步探究。
首先通過構建EZH1和EZH2的敲除鼠，發現在早期心臟發育過程中，EZH1和EZH2均通過修飾H3K27me3的形成來抑制異位基因的表達，以一種互補的方式調控心臟發育。而EZH1和EZH2基因的同時缺失，會使小鼠的心臟發育發生紊亂。
圖1 同時敲除Ezh1和Ezh2基因，會使小鼠的心臟發育過程紊亂
剛才研究的是心臟的發育，但是在心臟發生心梗后，心肌細胞再生的過程中，又是由哪一個亞基起作用呢？文章構建了EZH1、EZH2的敲除鼠，結果發現敲除EZH2基因的小鼠的心肌損傷程度以及心功能并沒有顯著性差異，而敲除EZH2基因的小鼠心臟損傷及心功能均有差異，這說明了心梗后心肌損傷的修復是由EZH1基因發揮著必不可少的調控作用。
圖2 對Ezh1和Ezh2基因進行敲除，發現Ezh1基因對于心肌細胞的再生是必須的
下面又進一步在敲除Ezh1基因的小鼠上，利用AAV為載體過表達EZH1基因，觀察EZH1基因的回復實驗。結果顯示EZH1基因在心梗后心肌細胞再生中發揮重要作用，并且可以改善心臟疾病(心肌梗塞)后心臟的重建與功能。
圖3 在Ezh1敲除鼠上，利用AAV為載體，過表達Ezh1，做回復實驗
為了進一步研究EZH1基因的深入機制，作者又在野生型小鼠上，通過AAV為載體過表達EZH1、EZH2基因，并進一步評價了過表達該基因后，心梗小鼠的心肌纖維化面積及心功能。在這個過程中，又利用ChIP-seq的方法，進一步發現EZH1 是通過促進形成轉錄激活相關的組蛋白修飾(H3K27me1和H3K4me3)而激活心臟發育相關基因的表達，調控心肌細胞的增殖，促進心臟再生，從而改善受損心臟功能。
圖4 在野生型心梗小鼠上，利用AAV為載體，過表達Ezh1，并深入探究其分子機制
該研究成果表明同一表觀調控因子，可以通過產生不同的組蛋白修飾密碼，導致截然不同的分子效應，最終卻殊途同歸—促進心臟形態與功能的重建與完善。
文章解析完了，那么慢病毒、腺病毒和腺相關病毒（AAV）等都是常用的病毒載體，在心血管系統的研究中我們又該如何選擇呢？
腺病毒：許多心血管疾病的研究會使用腺病毒載體進行，因為腺病毒對心肌細胞的感染效果較好，并且靶基因的表達效果較好。但是其表達是瞬時的(一般在心肌細胞中可持續１~４周)，并且會引起較強烈的免疫反應，導致實驗動物死亡。
圖5. 利用腺病毒載體過表達CXCR7 基因
慢病毒：慢病毒的優點是可以將靶基因整合入宿主的基因組中持續穩定的表達，引起的免疫反應較為溫和。但是其缺點是其對心血管系統的細胞(特別是心肌細胞)缺乏特異性的趨向性，實驗者往往需要通過心肌組織注射的方法來實現心肌細胞的轉染，而開胸實驗的難度大，動物致死率高，因此影響其廣泛應用。
圖6. 利用慢病毒載體過表達ORP4L基因
腺相關病毒（AAV）：與腺病毒相比，AAV具有更高的病毒轉染效率，并且AAV不需要與宿主的基因組整合，就能夠穩定持續的表達，運用AAV為載體的一個顯著優點是有些AAV血清型對于心肌細胞具有趨向性，因此現有的Ⅱ期臨床試驗，均使用AAV。其中AAV１、AAV６、AAV８和AAV９對骨骼肌和心肌的趨向性最高。
圖7. 利用腺相關病毒載體AAV過表達Ezh1、Ezh2基因
這里總結一下，如果各位老師想要利用病毒做小鼠的在體實驗，建議選擇AAV病毒，它具有滴度高，免疫原性低，并且1、6、8、9等血清型，對心臟都有較好的親和性，就可以不用通過復雜危險的開胸實驗，直接通過尾靜脈注射感染心臟組織。
吉凱基因現推出基于CRISPR/Cas9技術的基因敲除、定點突變、基因敲入技術，可以提供心肌細胞特異啟動子的條件型敲除和全身敲除大、小基因編輯鼠的構建服務。
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另外，關于心血管系統病毒注射可以參考這篇文章
