以新型藥物遞送系統為支撐的高端制劑是當今醫藥領域重要的新藥研發方向，其中AAV因為安全性好、宿主范圍廣、靶向性強被作為基因遞送的工具被廣泛使用。免疫細胞具有對炎癥組織固有的趨向性，在藥物靶向遞送的方面潛力巨大，已逐漸成為研發的熱點。參與非特異性免疫反應的細胞主要是吞噬細胞，包括巨噬細胞和中性粒細胞，還有自然殺傷細胞（NK細胞）。參與特異性免疫反應的細胞主要是淋巴細胞，包括T淋巴細胞和B淋巴細胞。關于AAV在免疫細胞中的靶向策略一直是大家關注的重點方向，接下來小編將從注射方式和實例分析兩個部分，分成上下兩期給大家進行講解。
免疫細胞不同的注射方式：
用AAV靶向免疫細胞的策略有三種：直接分離感染原代細胞；體外感染細胞再回輸；免疫細胞體內靶向注射。直接分離和感染原代細胞主要是針對T細胞；體外感染細胞再回輸策略是指從血液中分離免疫細胞，體外培養用AAV感染之后再輸送至體內。用AAV為載體的CAR-T和CAR-NK細胞療法本質就是一種體外靶向再回輸的策略；免疫細胞靶向注射就是用不同的方式注射AAV去定向感染免疫細胞。
小鼠T細胞分離步驟：
收集小鼠淋巴結：淋巴結通常位于小鼠的頸部、腋窩和腹股溝等部位。使用無菌手術器械，將淋巴結取出并放入含有PBS的離心管中；
制備單細胞懸液：將小鼠淋巴結放入含有PBS的離心管中，用無菌剪刀和注射器將淋巴結切碎，加入含有胰酶和DNA酶的消化液中。將混合物在37℃下消化1-2小時，然后使用無菌過濾器篩選出單細胞懸液；
分離T細胞：將單細胞懸液放入離心管中，加入含有T細胞抗體的磁珠，并在磁力架上進行分離。T細胞抗體能夠識別并結合T細胞表面的特定蛋白質，從而將T細胞與其他細胞分離開來。將T細胞分離后，使用流式細胞術或顯微鏡觀察T細胞的形態和數量；
培養T細胞：將分離出的T細胞放入含有營養物質和生長因子的培養基中，進行培養。
體外感染細胞再回輸[1]：
針對體外感染細胞主要是巨噬細胞、T細胞和NK細胞。
體外分離巨噬細胞步驟：
腹腔巨噬細胞被分離成單細胞，在腹腔內注射6ml冷的PBS，然后瀅注射器和針頭吸出4ml腹腔液，分離出單細胞懸浮液；
肝臟灌注之后解剖肝臟和肺部，將其切碎，用500μg/ml膠原酶和400μg/ml的DNA酶在37℃消化30min;
組織通過100μm的過濾器清洗兩次；
肝臟進一步在33%離心機中進行進一步處理，700g，15min；
紅血球細胞裂解出來，制備單細胞懸浮液。
針對免疫細胞的體內靶向注射：
針對免疫細胞的注射方式有尾靜脈注射、頸靜脈注射、門靜脈注射、氣管內注射、肌肉注射等
門靜脈注射核心步驟[2]：
暴露門靜脈：
對小鼠腹部從膀胱到劍突骨區域做一個2.5cm的皮膚切開；
使用同樣的方式打開腹部的肌肉層，使用組織拉鉤將打開的皮膚和肌肉固定在左右兩側；
將腸子移動到無菌紗布上并反轉胰腺暴露出門靜脈，門靜脈位于胰腺的底部。
病毒注射：
當門靜脈暴露后，向胰腺的門靜脈下方2mm處入針；
緩慢的將注射器中的超純AAV病毒注入血管；
注射完成后，用棉簽按壓30s,將腸子放回腹腔，縫合皮膚。
氣管內注射[3]：
暴露氣管：
將麻醉好的小鼠取出仰臥放置在手術板上，用醫用膠布固定小鼠四肢并用皮筋穿過門齒固定在手術板上，使其嘴端朝向操作者并呈45°夾角，在小鼠鼻孔上方放置連通氣體麻醉系統的軟管，確保整個實驗過程中小鼠處于穩定麻醉狀態；
在小鼠頸部上方放置一強光源（如fiber - lite?高強度光纖柔性光源，Dolan-Jenner Industries, MA United States），使得氣管、食管等組織可視化；
用不銹鋼的彎頭鉗輕輕地將小鼠的舌頭拉出至嘴的一側并保持，以便直接看到會厭和喉頭；
將鈍頭的90°彎曲的不銹鋼鑷子深入到舌下，將舌頭小心提起以便可以清楚的看到并進入氣管，微調至會厭清晰可見（如光線不足可調整頸部上方光源位置）；
用慣用手將套管針置于食指和中指之間，用拇指穩定套管，引導套管經口和喉頭進入氣管，至氣管分叉處立即停止前進，迅速移除金屬導絲，在套管的末端連接氣體麻醉系統導管，確保持續通氧氣及異氟烷；
病毒注射：
吸取適量病毒，待小鼠穩定時，短暫移去麻醉系統導管，使用移液器將病毒注入套管使小鼠吸入；
再將氣體麻醉系統導管與套管相連，維持5~10min；
對于AAV在不同免疫細胞中的靶向策略，我們吉凱基因也在收集相關資料整理成冊，方便各位老師的查閱參考。下表是針對不同免疫細胞的注射方式，各位老師可以快速查詢自己感興趣的免疫細胞。
具體細胞類型 | 注射方法 |
單核/巨噬細胞 | 尾靜脈注射 |
體外感染細胞，回輸小鼠 | |
頸靜脈 | |
門靜脈（肝巨噬細胞Kupffer） | |
氣管內注射（肺巨噬） | |
T細胞 | 肌肉注射 |
腹腔注射 | |
直接分離培養原代T細胞 | |
B細胞 | 靜脈注射 |
淋巴管內皮細胞 | 肌肉注射 |
樹突狀細胞 | 體外感染細胞，皮下注射小鼠 |
肌肉注射 |
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參考文獻…
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