mRNA技術作為一種新興的生物技術，具有巨大的應用潛力。從 mRNA 疫苗到 mRNA 藥物，這一技術為疾病的預防和治療提供了全新的思路。然而，mRNA 技術的發展并非一帆風順，其中最大的挑戰之一便是副產物雙鏈 RNA（dsRNA）的形成。dsRNA 作為一種免疫刺激分子，會引發機體的免疫反應，從而影響 mRNA 的安全性和有效性。因此，如何減少 dsRNA 的形成，成為 mRNA 技術領域亟待解決的關鍵問題。

傳統解決方案依賴繁瑣的純化工藝，但成本高、效率低，且難以徹底清除微量dsRNA。作為mRNA體外轉錄（IVT）的核心工具酶，T7 RNA聚合酶（T7 RNAP）的天然活性（如末端轉移酶和RNA依賴的RNA聚合酶活性）被認為是dsRNA形成的關鍵因素，如何通過定向進化或理性設計改造T7 RNAP，成為全球科研團隊競逐的焦點。

2024年3月3日，我們團隊在FEBS Journal發表題為Engineered T7 RNA polymerase reduces dsRNA formation by lowering terminal transferase and RNA-dependent RNA polymerase activities的研究論文。團隊成功通過工程化改造T7 RNAP，顯著降低體外轉錄過程中dsRNA的生成（僅為野生型的1.8%），且大幅度提升了合成mRNA的整體效率和質量，推動了基因治療、疫苗開發領域的跨越式發展。

我們創新性的通過結合定向進化和半理性設計的方法，成功篩選出多個高效低毒的T7 RNAP突變體，這些突變體在減少dsRNA形成方面表現出色。

我們構建了隨機突變庫，設計了一種可實時監測液滴內RNA產物的完整性與dsRNA含量的分子信標探針系統，利用熒光激活液滴分選（FADS）定向進化技術進行超高通量篩選。最終篩選出關鍵候選突變體Mut1（V214A）、Mut7（F162S/A247T）產生的dsRNA含量顯著低于野生型。

同時，我們通過半理性設計方法，構建了十個單點飽和突變庫，并利用微孔板篩選技術來識別有益的突變體。其中，微孔板篩選使用了雙探針，增加的5’-end探針用于檢測RNA產量。在篩選超過1000個突變體后，發現了關鍵候選突變體Mut11 (K180E)、Mut14 (A70Q)產生的dsRNA含量顯著低于野生型，并且未影響轉錄效率。

為了進一步優化，我們針對上述突變位點構建了DNA shuffling文庫，通過微孔板篩選，最終獲得組合突變體M17（A70Q/F162S/K180E）。實驗顯示，M17的dsRNA含量僅為野生型的1.8%，在篩選體系中僅為0.007 ng/μg。

這一結果不僅在體外實驗中得到了驗證，還在細胞實驗中表現出顯著的免疫原性降低和蛋白翻譯效率提升。我們將突變體轉錄的mRNA導入RAW264.7細胞后，最優突變體M11產物引發的干擾素β（IFN-β）的mRNA和蛋白表達量僅為野生型的9.7%和12.93 pg/mL。在HEK293細胞中，突變體mRNA的EGFP表達細胞數顯著增加，且熒光強度穩定。這表明，減少dsRNA可有效解除PKR介導的翻譯抑制，釋放mRNA治療潛力。

為了深入了解突變體降低dsRNA的作用機制，我們通過計算機模擬與功能實驗，揭示了突變體是由于降低了RNA依賴的RNA聚合酶（RDRP）活性和末端轉移酶活性而導致dsRNA的降低，這一發現為未來進一步優化 T7 RNAP提供了重要的理論依據。

本研究為T7 RNAP的改造提供了新的方法與思路，也為 mRNA 技術的發展注入了新活力。通過減少dsRNA的形成，提升了 mRNA 的質量和安全性。

憑借此項研究成果，我們成功推出了一款大幅降低 dsRNA 含量的GMP級別的T7 RNAP產品（Cat#10629，Cleascrip T7 RNA Polymerase GMP-grade (low dsRNA, 250 U/μL))。該產品在 mRNA 疫苗、mRNA 藥物等領域展現出廣泛的應用潛力，有望進一步推動 mRNA 技術的蓬勃發展，為生物醫學領域帶來更多的可能性。

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