脂肪組織適應(yīng)生理，病理和環(huán)境變化的能力非常出色。肥胖就是白色脂肪組織（WAT）對能量儲存需求增加的適應(yīng)。WAT在肥胖中的擴(kuò)張以性別和地區(qū)依賴的方式發(fā)生，其擴(kuò)張和重塑受到構(gòu)成WAT微環(huán)境的非實質(zhì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)。
單細(xì)胞測序（scRNA-seq）揭示了成人白色脂肪組織（WAT）含有功能多樣的間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞亞群。但迄今為止，這種細(xì)胞異質(zhì)性的分子基礎(chǔ)尚未完全確定。
近日，德克薩斯大學(xué)和下一代蛋白質(zhì)組學(xué)YCI實驗的研究團(tuán)隊聯(lián)合在Cell Metabolism（IF 27.3）上發(fā)表了“Multilayered omics reveal sex- and depot-dependent adipose progenitor cell heterogeneity”的文章，基于單細(xì)胞測序的數(shù)據(jù)分離出白色脂肪組織祖細(xì)胞亞群，通過微量蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)描述了脂肪組織祖細(xì)胞在三個維度上的mRNA和蛋白質(zhì)異質(zhì)性：細(xì)胞類型（WAT PDGFRβ+基質(zhì)細(xì)胞亞群），解剖定位（內(nèi)臟和皮下脂肪庫）和性別（雄性和雌性）。
研究材料
雄性和雌性小鼠腹腔和皮下白色脂肪組織分離的基質(zhì)細(xì)胞亞群
技術(shù)路線
· 步驟1：通過流式分選出細(xì)胞亞群，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的檢測；
· 步驟2：基于組學(xué)數(shù)據(jù)，分析細(xì)胞亞群的功能，性別和儲庫對細(xì)胞功能的影響，確認(rèn)細(xì)胞亞群的關(guān)鍵分子機(jī)制；
· 步驟3：利用CRISPR Cas9及其他體外實驗驗證細(xì)胞亞群功能及機(jī)制。
研究結(jié)果
為了更加深入了解脂肪祖細(xì)胞的異質(zhì)性，同時考慮到脂肪儲庫和性別差異，利用流式分選的方法從雄性和雌性小鼠WAT中分別分離了四種主要的祖細(xì)胞亞群——PDGFRβ+細(xì)胞亞群，包括來自腹腔gWAT的APCs和纖維炎性祖細(xì)胞（FIPs）,來自皮下iWAT的DPP4-APC和DPP4+APC亞群，進(jìn)行DIA微量蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)的檢測。綜合比較發(fā)現(xiàn)不同細(xì)胞群的功能異質(zhì)性高于儲庫或性別差異。
有研究發(fā)現(xiàn)WAT PDGFRβ+細(xì)胞亞群之間的代謝活性顯著不同，脂肪形成與促炎表型受到線粒體代謝的強(qiáng)烈調(diào)節(jié)。因此將注釋為代謝相關(guān)的556種蛋白質(zhì)的表達(dá)豐度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)即使在穩(wěn)定狀態(tài)下，不同亞群之間代謝存在較大差異。而線粒體相關(guān)的145種蛋白質(zhì)的表達(dá)以及參與脂質(zhì)代謝的35種蛋白質(zhì)均可以清晰的區(qū)分雄性與雌性來源細(xì)胞。總之，將細(xì)胞亞群分離后進(jìn)行組學(xué)分析可以對細(xì)胞群體的分子和功能異質(zhì)性有更加深入的了解。
圖1 蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析
2. 蛋白質(zhì)-mRNA相關(guān)性不佳
接下來比較了細(xì)胞亞群層面上蛋白質(zhì)和mRNA的相關(guān)性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在成對的4540對蛋白質(zhì)-mRNA中，有1800對顯著性相關(guān)，2740對無顯著相關(guān)性。又將4540個共享基因根據(jù)蛋白質(zhì)豐度CV值分為10組，研究CV值和蛋白質(zhì)-mRNA相關(guān)性之間的關(guān)系。結(jié)果表明蛋白質(zhì)和mRNA水平之間的相關(guān)性受蛋白質(zhì)和轉(zhuǎn)錄水平豐度變化的高度影響。同時，又比較了性別、儲庫、細(xì)胞亞群、及某些通路或基因集層面上蛋白質(zhì)與mRNA的相關(guān)性，觀察結(jié)果表明轉(zhuǎn)錄水平并不能準(zhǔn)確預(yù)測其蛋白質(zhì)豐度，多組學(xué)聯(lián)合可以提供單組學(xué)無法獲得的附加信息。
圖2 mRNA和蛋白質(zhì)相關(guān)性比較
3. 蛋白質(zhì)組學(xué)顯示iWAT-APCs分化存在性別差異
數(shù)據(jù)表明前體細(xì)胞中很多基因呈現(xiàn)性別依賴性表達(dá)。如雄性小鼠中iWAT-APCs在高脂飲食時對脂肪形成具有抗性，而gWAT-APCs被激活進(jìn)而分化；雌性小鼠中iWATs和gWAT均可觀察到新生脂肪形成。即雌性和雄性的iWAT-DPP4- APCs存在性別差異。蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)集的GSEA分析也揭示了這種差異，特別是與WAT重塑相關(guān)的途徑，包括雌激素反應(yīng)、缺氧等。同時發(fā)現(xiàn)這些差異在蛋白質(zhì)水平上比在mRNA水平上更為明顯。
圖3 基于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的GSEA分析
4. PPARγ磷酸化水平是iWAT-APC分化性別差異的基礎(chǔ)
PPARγ是脂肪生成的主要調(diào)節(jié)因子。脂肪祖細(xì)胞內(nèi)的缺氧誘導(dǎo)因子1a（HIF1A）活化會觸發(fā)PPARγ信號級聯(lián)，導(dǎo)致PPARγ的S112位點發(fā)生磷酸化，從而抑制PPARγ活性。不同性別中“缺氧”特征的差異表明PPARγS112磷酸化水平可能是PPARγ活性性別依賴的基礎(chǔ)。通過高脂飲食喂養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)雌性iWAT PDGFRβ+細(xì)胞中磷酸化PPARγ的水平明顯低于雄性。這表明在飲食誘導(dǎo)的肥胖環(huán)境中，PPARγ在APCs中的活性存在性別差異。遺傳譜系追蹤分析也進(jìn)一步驗證了HFD喂養(yǎng)會導(dǎo)致雌性小鼠iWAT中新生脂肪細(xì)胞增多。
圖4 不同性別的PPARγ磷酸化水平及成脂差異
5. gWAT APCs和FIPs的功能注釋
根據(jù)體內(nèi)外轉(zhuǎn)錄分析及后續(xù)功能研究證實，APCs是代表gWAT高度定型的前脂肪細(xì)胞，而FIPs表現(xiàn)出促炎作用并調(diào)節(jié)高脂環(huán)境的免疫細(xì)胞穩(wěn)定。基于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的GSEA分析結(jié)果中，與雄性FIPs相比，雄性APCs富集與脂肪生成相關(guān)的途徑；此外，APCs還富含脂肪酸代謝和膽汁酸代謝的特征，而經(jīng)由NF-κB的TNF信號通路在FIPs中顯著富集。利用IPA分析預(yù)測APCs和FIPs的潛在調(diào)控機(jī)制，發(fā)現(xiàn)谷胱甘肽介導(dǎo)的解毒和芳烴受體（AhR）信號傳導(dǎo)是雄性APCs中最上調(diào)的途徑之一。
圖5 基于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的GSEA及IPA分析
6. GSTM1是APC細(xì)胞氧化還原平衡所必須的
谷胱甘肽代謝控制細(xì)胞內(nèi)的氧化還原穩(wěn)態(tài)，是許多細(xì)胞過程的必要條件。谷胱甘肽以還原（GSH）和氧化（GSSG）形式存在，GSH:GSSG的比例指示氧化還原狀態(tài)和氧化應(yīng)激。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）是gWAT-APCs中最富集的蛋白質(zhì)之一。GST參與GSH途徑的氧化還原反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)GSH:GSSG比率，而GSTM1是豐度最高的。研究發(fā)現(xiàn)在APCs中，隨著細(xì)胞分化，GSH:GSSG顯著降低。而改變GSH:GSSG比率，會影響APCs的分化，但對FIPs無明顯作用。在APCs自發(fā)分化過程中，GSTM1 RNA和蛋白質(zhì)均穩(wěn)定增加，利用CRISPR基因編輯技術(shù)抑制APCs和FIPs細(xì)胞中的GSTM1，GSH:GSSG比率的下降幾乎被完全阻斷，也就說明GSTM1作為gWAT-APCs中細(xì)胞內(nèi)谷胱甘肽代謝的主要酶。
圖6 APCs細(xì)胞內(nèi)氧化還原穩(wěn)態(tài)
7. AhR信號抑制FIPs和APCs炎癥反應(yīng)
AhR是參與調(diào)節(jié)各種細(xì)胞類型的炎癥反應(yīng)的受體和轉(zhuǎn)錄因子。通過CRISPR-Cas9構(gòu)建AhR缺陷型ACPs和FIPs，用LPS處理后采用微量蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示ACPs和FIPs的促炎基因表達(dá)水平提升，包括細(xì)胞因子/趨化因子。收集添加LPS的AhR缺陷型FIPs的培養(yǎng)基，用于培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞被活化。這表明AhR缺陷型FIPs表現(xiàn)出增強(qiáng)的促炎表型。
圖7 促炎基因的表達(dá)
小編小結(jié)
單細(xì)胞層面的研究使得我們更加清楚看到每個細(xì)胞的特征，看到組織中復(fù)雜的細(xì)胞群體的構(gòu)成，以及新的細(xì)胞亞群等等。但細(xì)胞亞群的分子異質(zhì)性很難在單細(xì)胞層面去研究。本研究將單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵細(xì)胞亞群分別分離出來進(jìn)行蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的檢測，探索了蛋白質(zhì)/基因的分子機(jī)制，對細(xì)胞亞群的異質(zhì)性有了更加深入的了解。
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