脂肪組織適應生理，病理和環境變化的能力非常出色。肥胖就是白色脂肪組織（WAT）對能量儲存需求增加的適應。WAT在肥胖中的擴張以性別和地區依賴的方式發生，其擴張和重塑受到構成WAT微環境的非實質細胞的調節。
單細胞測序（scRNA-seq）揭示了成人白色脂肪組織（WAT）含有功能多樣的間充質基質細胞亞群。但迄今為止，這種細胞異質性的分子基礎尚未完全確定。
近日，德克薩斯大學和下一代蛋白質組學YCI實驗的研究團隊聯合在Cell Metabolism（IF 27.3）上發表了“Multilayered omics reveal sex- and depot-dependent adipose progenitor cell heterogeneity”的文章，基于單細胞測序的數據分離出白色脂肪組織祖細胞亞群，通過微量蛋白質組學和轉錄組學描述了脂肪組織祖細胞在三個維度上的mRNA和蛋白質異質性：細胞類型（WAT PDGFRβ+基質細胞亞群），解剖定位（內臟和皮下脂肪庫）和性別（雄性和雌性）。
研究材料
雄性和雌性小鼠腹腔和皮下白色脂肪組織分離的基質細胞亞群
技術路線
· 步驟1：通過流式分選出細胞亞群，進行轉錄組學和蛋白質組學的檢測；
· 步驟2：基于組學數據，分析細胞亞群的功能，性別和儲庫對細胞功能的影響，確認細胞亞群的關鍵分子機制；
· 步驟3：利用CRISPR Cas9及其他體外實驗驗證細胞亞群功能及機制。
研究結果
為了更加深入了解脂肪祖細胞的異質性，同時考慮到脂肪儲庫和性別差異，利用流式分選的方法從雄性和雌性小鼠WAT中分別分離了四種主要的祖細胞亞群——PDGFRβ+細胞亞群，包括來自腹腔gWAT的APCs和纖維炎性祖細胞（FIPs）,來自皮下iWAT的DPP4-APC和DPP4+APC亞群，進行DIA微量蛋白質組學和轉錄組學的檢測。綜合比較發現不同細胞群的功能異質性高于儲庫或性別差異。
有研究發現WAT PDGFRβ+細胞亞群之間的代謝活性顯著不同，脂肪形成與促炎表型受到線粒體代謝的強烈調節。因此將注釋為代謝相關的556種蛋白質的表達豐度進行比較，發現即使在穩定狀態下，不同亞群之間代謝存在較大差異。而線粒體相關的145種蛋白質的表達以及參與脂質代謝的35種蛋白質均可以清晰的區分雄性與雌性來源細胞?？傊?strong>將細胞亞群分離后進行組學分析可以對細胞群體的分子和功能異質性有更加深入的了解。
圖1 蛋白質組和轉錄組數據分析
2. 蛋白質-mRNA相關性不佳
接下來比較了細胞亞群層面上蛋白質和mRNA的相關性，結果發現在成對的4540對蛋白質-mRNA中，有1800對顯著性相關，2740對無顯著相關性。又將4540個共享基因根據蛋白質豐度CV值分為10組，研究CV值和蛋白質-mRNA相關性之間的關系。結果表明蛋白質和mRNA水平之間的相關性受蛋白質和轉錄水平豐度變化的高度影響。同時，又比較了性別、儲庫、細胞亞群、及某些通路或基因集層面上蛋白質與mRNA的相關性，觀察結果表明轉錄水平并不能準確預測其蛋白質豐度，多組學聯合可以提供單組學無法獲得的附加信息。
圖2 mRNA和蛋白質相關性比較
3. 蛋白質組學顯示iWAT-APCs分化存在性別差異
數據表明前體細胞中很多基因呈現性別依賴性表達。如雄性小鼠中iWAT-APCs在高脂飲食時對脂肪形成具有抗性，而gWAT-APCs被激活進而分化；雌性小鼠中iWATs和gWAT均可觀察到新生脂肪形成。即雌性和雄性的iWAT-DPP4- APCs存在性別差異。蛋白質組學數據集的GSEA分析也揭示了這種差異，特別是與WAT重塑相關的途徑，包括雌激素反應、缺氧等。同時發現這些差異在蛋白質水平上比在mRNA水平上更為明顯。
圖3 基于蛋白質組學數據的GSEA分析
4. PPARγ磷酸化水平是iWAT-APC分化性別差異的基礎
PPARγ是脂肪生成的主要調節因子。脂肪祖細胞內的缺氧誘導因子1a（HIF1A）活化會觸發PPARγ信號級聯，導致PPARγ的S112位點發生磷酸化，從而抑制PPARγ活性。不同性別中“缺氧”特征的差異表明PPARγS112磷酸化水平可能是PPARγ活性性別依賴的基礎。通過高脂飲食喂養后，發現雌性iWAT PDGFRβ+細胞中磷酸化PPARγ的水平明顯低于雄性。這表明在飲食誘導的肥胖環境中，PPARγ在APCs中的活性存在性別差異。遺傳譜系追蹤分析也進一步驗證了HFD喂養會導致雌性小鼠iWAT中新生脂肪細胞增多。
圖4 不同性別的PPARγ磷酸化水平及成脂差異
5. gWAT APCs和FIPs的功能注釋
根據體內外轉錄分析及后續功能研究證實，APCs是代表gWAT高度定型的前脂肪細胞，而FIPs表現出促炎作用并調節高脂環境的免疫細胞穩定?；诘鞍踪|組學數據的GSEA分析結果中，與雄性FIPs相比，雄性APCs富集與脂肪生成相關的途徑；此外，APCs還富含脂肪酸代謝和膽汁酸代謝的特征，而經由NF-κB的TNF信號通路在FIPs中顯著富集。利用IPA分析預測APCs和FIPs的潛在調控機制，發現谷胱甘肽介導的解毒和芳烴受體（AhR）信號傳導是雄性APCs中最上調的途徑之一。
圖5 基于蛋白質組學數據的GSEA及IPA分析
6. GSTM1是APC細胞氧化還原平衡所必須的
谷胱甘肽代謝控制細胞內的氧化還原穩態，是許多細胞過程的必要條件。谷胱甘肽以還原（GSH）和氧化（GSSG）形式存在，GSH:GSSG的比例指示氧化還原狀態和氧化應激。谷胱甘肽-S-轉移酶（GST）是gWAT-APCs中最富集的蛋白質之一。GST參與GSH途徑的氧化還原反應，從而調節GSH:GSSG比率，而GSTM1是豐度最高的。研究發現在APCs中，隨著細胞分化，GSH:GSSG顯著降低。而改變GSH:GSSG比率，會影響APCs的分化，但對FIPs無明顯作用。在APCs自發分化過程中，GSTM1 RNA和蛋白質均穩定增加，利用CRISPR基因編輯技術抑制APCs和FIPs細胞中的GSTM1，GSH:GSSG比率的下降幾乎被完全阻斷，也就說明GSTM1作為gWAT-APCs中細胞內谷胱甘肽代謝的主要酶。
圖6 APCs細胞內氧化還原穩態
7. AhR信號抑制FIPs和APCs炎癥反應
AhR是參與調節各種細胞類型的炎癥反應的受體和轉錄因子。通過CRISPR-Cas9構建AhR缺陷型ACPs和FIPs，用LPS處理后采用微量蛋白質組學進行檢測，結果顯示ACPs和FIPs的促炎基因表達水平提升，包括細胞因子/趨化因子。收集添加LPS的AhR缺陷型FIPs的培養基，用于培養巨噬細胞，發現巨噬細胞被活化。這表明AhR缺陷型FIPs表現出增強的促炎表型。
圖7 促炎基因的表達
小編小結
單細胞層面的研究使得我們更加清楚看到每個細胞的特征，看到組織中復雜的細胞群體的構成，以及新的細胞亞群等等。但細胞亞群的分子異質性很難在單細胞層面去研究。本研究將單細胞測序發現的關鍵細胞亞群分別分離出來進行蛋白質組和轉錄組的檢測，探索了蛋白質/基因的分子機制，對細胞亞群的異質性有了更加深入的了解。
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