靶向CD19的CAR-T細胞（嵌合抗原受體T細胞）療法是治療復發或難治性B細胞惡性腫瘤的有效選擇。共刺激結構域對CAR-T療法的臨床療效至關重要，共刺激可增強細胞因子的產生、增殖和修飾T細胞的持久性。FDA批準臨床使用的2個主要的共刺激結構域CD28和4-1BB的CAR-T臨床反應率非常相似，但其細胞產物的動力學和表型存在顯著差異。
2020年7月，來自美國馬薩諸塞總醫院研究團隊在 Molecular Therapy （IF 11.452）上發表題為“A Distinct Transcriptional Program in Human CAR T Cells Bearing the 4-1BB Signaling Domain Revealed by scRNA-Seq”的研究文章，該研究整合了第一代和第二代人CAR T細胞的RNA測序(RNA-seq)和單細胞RNA測序(scRNA-seq) 數據，制作了人類CAR T細胞在靜息和激活狀態下的轉錄圖譜，揭示了CARs胞內結構域介導的非抗原依賴性信號（Tonic signaling）和抗原依賴性信號通路。
研究材料
T細胞
技術路線
步驟1：用于轉錄分析的CAR-T細胞的CAR設計、轉導和制備；
步驟2：CAR或TCR激活的CAR-T細胞信號特征；
步驟3：結構性轉錄譜變化：靜息的CAR-T細胞具有CD3ζ和共刺激結構域的Tonic信號；
步驟4：抗原刺激轉錄變化：BBζ CAR T細胞中的抗原刺激導致與MHC II類基因表達相關的激活程序持續上調；
步驟5：抗原刺激誘導攜帶4-1BB和CD28共刺激結構域的CARS CD4+T細胞 Th1/Th2極化。
研究結果
1. 用于轉錄分析的CAR-T細胞的CAR設計、轉導和制備
研究人員為了確定不同CARs下游的轉錄差異，合成四個帶有不同信號域的CD19 CAR結構。從健康捐獻者的外周血液中分離出CD4+和CD8+初級T細胞等比例混合，用抗CD3/CD28珠子激活，分別轉導四種CAR結構(ζ、28ζ、BBζ和δζ)，或者不轉導(UT)，通過CAR (內源性表達CD19的Nalm6細胞) 或TCR (使用珠子) 刺激4h或24h后進行轉錄組和單細胞轉錄組分析。
圖1 CD19 CAR載體設計、轉導以及實驗流程
2. CAR或TCR激活的CAR-T細胞信號特征
為了研究不同CAR T細胞群體間變異的主要驅動因素，研究人員首先分析RNA-Seq數據，觀察到T細胞激活后的轉錄反應根據T細胞接受刺激的時間和類型的不同而不同。為了確定差異源于每個細胞內刺激的程度或種類的差異而不是受到刺激的細胞百分比的不同，研究人員轉向scRNA-seq圖譜分析，發現T細胞刺激的主要差異也反映在單個細胞圖譜上。進一步比較TCR和CAR刺激的T細胞和未刺激的T細胞中表達的基因，發現與TCR刺激相比，通過CAR刺激CAR T細胞產生更弱但相似的T細胞激活信號。
圖2 通過CAR抗原刺激CAR T細胞比通過抗CD3TCR刺激產生更弱但相似的T細胞激活信號
3. 結構性轉錄變化：靜息的CAR-T細胞具有CD3ζ和共刺激結構域的Tonic信號
為了分析與配體無關的信號，即“Tonic signaling”，研究人員檢查了靜息的CAR T細胞之間的差異：轉錄組數據表明攜帶功能性CD3ζ鏈的CAR在靜止狀態下有一個特定的、不依賴于抗原刺激的轉錄信號；單細胞轉錄組數據分析，靜息狀態下，只有bbζ CAR T細胞在群中的分布與所有其他細胞不同，進一步說明來自共刺激結構域的信號，特別是4-1BB，可以獨立于抗原刺激之外來調節T細胞程序。
圖3 靜息CAR T細胞的轉錄信號表明通過CD3ζ和共刺激結構域的Tonic信號
4. 抗原刺激轉錄變化：BBζ CAR T細胞中的抗原刺激導致與MHC II類基因表達相關的激活程序的持續上調
接下來研究人員檢查了CAR T細胞在抗原刺激后的轉錄變化，以及共刺激之間是存在轉錄差異：與靜息和激活后的所有其他CAR細胞相比，HLA-DR在bbζ CAR T細胞中表達上調，且適用于激活后的抗EGFR T細胞，表明這種差異表達在bbζ CAR T細胞中是獨立于CAR抗原結合域的。
為了確定這些基因是否是針對bbζ car T細胞中4-1BB的表達，而不是CD28的缺失，進一步比較了bbζ和ζ car T細胞之間的差異基因，發現在BBζ和28ζ中上調的基因同樣上調，表明4-1BB的存在正向誘導這些基因的表達。
圖4 帶有4-1BB共刺激結構域的CAR T細胞持續上調MHCⅡ類基因
5. 抗原刺激誘導攜帶4-1BB和CD28共刺激結構域的CARS CD4+T細胞 Th1/Th2極化
為了確定CAR共刺激結構域使CD4+T細胞分化，研究人員分析了CD4+bbζ 或28ζ CAR T細胞中Th1和Th2極化基因的表達：在CAR刺激和靜息狀態下，CD4+bbζ CAR T細胞中Th1極化基因增強，而激活的28ζ 細胞中Th2早期極化基因豐富。CAR共刺激結構域的類型在CAR T細胞的極化中起著重要作用，尤其是在CAR刺激后。
單細胞轉錄組數據分析：觀察到BBζ CAR T細胞與其他活化的CAR T細胞分離，而含有28ζ 和 ζ 的CAR T細胞的分布相似。潛在的狄利克雷分配（LDA）或“主題建?！狈椒ǚ治鰡蝹€免疫細胞的特征，表明不同的T細胞亞群可以激活類似的程序。
圖5 攜帶4-1BB共刺激結構域的CARs的抗原刺激導致顯著的Th1極化
小結
這項研究中采用兩種測序方法（轉錄組與單細胞轉錄組）和無偏分析，生成了人類CAR T細胞在靜止狀態和激活后的轉錄圖譜，揭示了CAR 細胞內結構域介導的非抗原依賴和抗原依賴的信號。發現靜息CAR T細胞具有配體獨立的信號，并隨著共刺激域而變化。共刺激結構域的基線CAR中的組成性信號以及激活后的信號變化，會影響CAR T細胞表型、細胞命運和持久性。本研究擴展了我們對CAR信號域如何影響基因表達譜，功能狀態和工程化人類T細胞最終命運的理解，為CAR T臨床個性化治療提供了新的理論基礎。
中科優品推薦
【中科新生命】單細胞多組學平臺可提供基于10x genomics Chromium controller、10x genomics Chromium X的單細胞轉錄組測序服務以及“一站式”單細胞蛋白質組服務，為腫瘤免疫、發育生物學、大規模單細胞圖譜、高通量藥物篩選、稀有細胞鑒定分析等熱門領域提供超強助力。
