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鈣離子濃度變化是活細胞接受外界刺激后產生級聯反應的重要信息傳遞方式，因此細胞內鈣離子檢測是信號轉導G蛋白偶聯受體（GPCR）介導的相關藥物篩選以及其他相關實驗中非常重要的一種研究手段，該領域中常使用鈣離子熒光探針與鈣離子的特異性結合來觀察細胞內鈣離子濃度水平的變化，此類探針未結合Ca²⁺前幾乎無熒光，結合Ca²⁺后，熒光強度顯著增強，所顯示光譜可被熒光顯微鏡、流式細胞術、熒光光譜法以及熒光酶標儀等多種方法檢測。

常用的Ca²⁺熒光探針根據波長的不同，分為兩大類：

第一類：可見光激發Ca²⁺熒光探針

與紫外光激發的熒光探針相比，如Fura-2和Indo-1，可見光激發Ca²⁺探針具有以下特點：

1）適用于大多數的激光共聚焦測鈣系統，包括共聚焦激發掃描顯微鏡以及流式細胞儀等。

2）具有更強的染料吸收性能，使得更低濃度的探針即可成功檢測Ca²⁺變化，從而降低了對活細胞的光毒性。

3）Ca²⁺依賴性熒光強度增強，對Ca²⁺變化水平檢測敏感度更高。

4）降低樣品自熒光以及光散射的干擾。

5）兼容光激活探針以及UV-激發試劑，因此更方便于多參數檢測。5）無光譜偏移。

介紹幾種最受歡迎的可見光激發Ca²⁺熒光探針：

1）Fluo-3

Fluo-3是最常用的可見光激發Ca²⁺熒光探針，較高的Ca²⁺結合力可捕捉細胞內Ca²⁺信號的動力學變化，使用于多種流式細胞術相關實驗，如籠鎖Ca²⁺螯合劑光活化、第二信使、神經傳導物質研究以及細胞水平的藥物篩選等。Fluo-3游離配體幾乎是非熒光性的，其熒光不會隨鈣離子濃度升高而增強。但是，當它與細胞內鈣離子結合后可以產生較強的熒光，熒光會增加60至100倍，最大激發波長為?506nm，最大發射波長為?526nm。實際檢測時推薦使用的激發波長為488nm左右，發射波長為525～530nm。可以使用激光共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測細胞內鈣離子濃度的變化。

2）Fluo-4

Fluo-4是鈣指示劑Fluo-3的升級版本，主要變化為后者分子上的兩個氯原子被Fluo-4上的氟所取代，該結構上的微小變化使Fluo-4,AM加載更快，在相同濃度下檢測信號更強。

3）Rhod-2

Rhod-2是另一種可見光激發的高親和力Ca²⁺指示劑，與其他可見光激發熒光探針如Fluo-3/4相比，Rhod-2具有長波長，更適用于檢測具有較高自熒光現象的細胞和組織內鈣離子水平以及檢測由光感受器和籠鎖Ca²⁺螯合劑光激活導致的鈣離子釋放。

圖?Fluorescence emission spectra at equal concentrations of fluo-4 (blue) and fluo-3 (red) in solutions containing 0–39.8 μM free Ca²⁺.

你所不知道的秘密：為什么許多熒光探針會有R-AM或者R的形式提供？以Fluo-4或Fluo-4, AM為例。

常規的熒光探針如Fluo-4屬極性大的酸性化合物，無法進入細胞內。此時，若想做細胞內染色，需要通過膜片微電極（patch pipette），顯微注射（microinjection），胞引作用加載試劑等手段，輔助實現藥物加載，何其麻煩??！

為此，而通過在Fluo-4的負性基團上結合乙酰氧甲酯（AM），該單一的變化既增加了酯溶性又消除了負電荷，極大的提高了細胞滲透性。只需要把細胞孵育在含藥物的培養液中，即可實現加載，非常省事。而一旦Fluo-4 AM進入細胞后，酯化鈣離子熒光探針被酯酶水解，恢復Fluo-4，在胞內完全發揮其正常生理功能。?

產品信息

“*”：對于本貨號40703ES50，以溶于DMSO的2mM儲存液形式供貨，供貨規格50μl（相當于112μg）；

“**”：對于本貨號40703ES50，以粉末形式提供，50μg，價格為368元。

第二類：紫外光激發Ca²⁺熒光探針

Fura-2和Indo-1均屬可見光激發Ca²⁺熒光指示劑，也是目前最常用的比率測量熒光探針。與第一代染料Quin-2相比，Fura-2和Indo-1發出更強的熒光，在生理pH范圍內對pH變化不敏感。與Mg²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Fe²⁺等二價金屬離子相比，對Ca²⁺有更高的選擇性，因此得到了廣泛應用，同時作為雙波長熒光染料在標定Ca²⁺濃度時不再單純依靠熒光強度的變化。

1）Fura-2

2）Indo-1

Fura-2是雙激發波長熒光染料，Indo-1是雙發射波長熒光染料，均采用比率測量方法，該方法可以消除不同細胞樣品間熒光探針裝載效率的差異，熒光探針的滲漏，細胞厚度差異等一些誤差因素。Fura-2特別適合于數字成像顯微鏡，使用該設備可更方便的調整激發波長，使探針結合鈣離子后在300-400nm的激發波長范圍內掃描Fura-2的吸收偏移，在510nm處檢測發射波長。相比之下，Indo-1更傾向于流式細胞術檢測，使用該設備可實現在氬離子激光器的351-364光譜范圍內單一波長的激發，在400nm和480nm的波長處分別檢測結合鈣離子和未結合鈣離子的熒光信號，通過二者的比值確定鈣離子的濃度。Fura-2,AM和Indo-1,AM分別是Fura-2和Indo-1的乙酰氧甲酯（AM）衍生物，具有活細膜滲透性。

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