血管侵犯是肝細(xì)胞癌（HCC）肝內(nèi)轉(zhuǎn)移以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要途徑，也是一個(gè)強(qiáng)有力的負(fù)面預(yù)后因素。環(huán)狀 RNA（circRNA）在腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要作用。然而，circRNAs 在 HCC 血管侵襲發(fā)展過程中的調(diào)控功能和內(nèi)在機(jī)制尚不清楚。
今年十月份，四川大學(xué)華西醫(yī)院在Molecular Cancer上發(fā)表了一篇名為circPSD3 is a promising inhibitor of uPA system to inhibit vascular invasion and metastasis in hepatocellular carcinoma的文章，通過體內(nèi)體外的實(shí)驗(yàn)證明circPSD3是uPA系統(tǒng)一種很有前景的抑制劑。circPSD3是HCC血管侵襲和轉(zhuǎn)移的重要調(diào)節(jié)因子，可作為預(yù)后生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。
研 究 結(jié) 果
circPSD3是PVTT形成的潛在調(diào)節(jié)因子
為了篩選出在HCC細(xì)胞中參與到血管侵襲的circRNA，針對5個(gè)配對的PVTT和HCC組織研究人員做了相關(guān)的circRNA-seq。一共檢測到13238個(gè)circRNA，通過一定的篩選標(biāo)準(zhǔn)由100個(gè)circRNA被識別出來。在PVTT組織中，有46個(gè)上調(diào)，有54個(gè)顯著的下調(diào)。結(jié)果表明，PVTT組織中存在高度的異質(zhì)性。
為了進(jìn)一步確認(rèn)circRNA參與到血管侵襲，研究人員針對19組PVTT和HCC配對的組織中選擇了8個(gè)顯著下調(diào)的circRNA，通過qpcr,利用不同的引物擴(kuò)增了目標(biāo)circRNA，結(jié)果表明只有circPSD3在HCC組織中顯著下調(diào)。在circRNA-seq中也是circPSD3顯著下調(diào)（fog1C）。之后通過癌和癌旁組織中circPSD3在HCC組織中明顯下降（fig1D）。對于MVI組circPSD3的水平比non-MVI組低（fig1E），并且生存曲線表明，circPSD3和生存相關(guān)（figF、G）。因此，circPSD3被選為調(diào)控血管侵襲和轉(zhuǎn)移的候選circRNA，并且進(jìn)一步對其做了深入研究。
通過fig1H表明，circPSD3是由PSD3基因的13、14號外顯子剪切形成的。為了確認(rèn)環(huán)狀circPSD3的性質(zhì)，研究人員做了一系列的實(shí)驗(yàn)。首先，通過對HCC細(xì)胞的circPSD3進(jìn)行接頭處的桑格測序。通過對cDNA和gDNA的檢測，證實(shí)了circPSD3的存在（figI、J）。最終，通過核質(zhì)分離和FISH實(shí)驗(yàn)表明：circPSD3優(yōu)先表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)中。
TDP43抑制了HCC中circPSD3的生物合成
很多RNA結(jié)合蛋白會調(diào)節(jié)circRNA的生物合成，通過circInteractome工具，研究人員找到了circPSD3 pre-mRNA下游內(nèi)含子TDP43三個(gè)假定的結(jié)合位點(diǎn)（fig2A）。TDP43介導(dǎo)RNA代謝的多個(gè)方面。為了證實(shí)TDP43和mRNA的相互作用，設(shè)計(jì)了五對引物（fig2B）。之后，通過RIP實(shí)驗(yàn)，使用TDP43的抗體，結(jié)果表明TDP32只富集了引物E的目的序列，表明TDP43通過引物E形成了蛋白-RNA復(fù)合物（fig2C）。通過癌和癌旁組織的比較，在HCC組織中circPSD3顯著上調(diào)，通過WB也驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果（fig2E、F）。通過Pearson相關(guān)性分析表明在PVTT組織中TDP43和circPSD3呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)（fig2G）。在HCC細(xì)胞中，TDP43的減少會顯著降低circPSD3的表達(dá)（fig2H-J）。這些結(jié)果都表明，TDP43會抑制circPSD3的生物合成，circPSD3可能會介導(dǎo)TDP43對于HCC細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)作用。
circPSD3會抑制體內(nèi)HCC細(xì)胞的遷移和侵襲
為了探究circPSD3在HCC形成中的作用，在這里研究人員使用了兩個(gè)過表達(dá)的慢病毒以及針對circPSD3的接頭處的干擾的慢病毒。通過qpcr實(shí)驗(yàn)表明在HCC細(xì)胞中circPSD3被成功的過表達(dá)或者敲低（fig3A-D）。在傷口愈合的實(shí)驗(yàn)中，對于circPSD3的過表達(dá)會顯著降低HCC細(xì)胞的遷移，circPSD3的敲低會顯著增強(qiáng)HCC細(xì)胞的遷移（fig3E、F）。在劃痕實(shí)驗(yàn)中，circPSD3的過表達(dá)會使得HCC的遷移和侵襲消失（fig3G、H）。3D的侵襲實(shí)驗(yàn)?zāi)M了HCC細(xì)胞在體內(nèi)的侵襲。在SK-Hep-1細(xì)胞中，circPSD3過表達(dá)會耗竭細(xì)胞的侵襲面積以及突起數(shù)量。但是CCK8實(shí)驗(yàn)表明，circPSD3對細(xì)胞的增殖沒有影響（fig3I、J）。
circPSD3抑制HCC細(xì)胞中遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和血管侵襲
為了進(jìn)一步加深體內(nèi)的研究，建立了肺轉(zhuǎn)移以及肝臟原位模型。HE染色表明circPSD3的過表達(dá)顯著減少了肺部轉(zhuǎn)移灶的數(shù)量（fig4A）。過表達(dá)circPSD3可以顯著減少肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（fig4b）。為了評估circPSD3對肝內(nèi)血管侵襲的影響，對肝組織進(jìn)行切片和HE染色，結(jié)果表明過表達(dá)circPSD3會顯著降低細(xì)胞的血管侵襲能力，相反敲除circPSD3會增加肺轉(zhuǎn)移以及肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（fig4C、D）。綜上，這些結(jié)果表明circPSD3在抑制癌細(xì)胞和血管侵襲和轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。
circPSD3調(diào)節(jié)uPA系統(tǒng)
為了探究circPSD3在HCC細(xì)胞中的調(diào)節(jié)機(jī)制，研究人員在轉(zhuǎn)染了過表達(dá)circPSD3d的HCC細(xì)胞上用RNA-seq進(jìn)行了檢測，通過不同的篩選標(biāo)準(zhǔn)，RNA-seq共鑒定出240個(gè)失調(diào)基因，其中42個(gè)基因明顯上調(diào)，178個(gè)基因明顯下調(diào)（fig5A）。富集分析發(fā)現(xiàn)這些基因和很多腫瘤相關(guān)的通路相關(guān)，包括PI3K-AKT, MAPK、ECM-受體等通路。通過qPCR驗(yàn)證了5個(gè)上調(diào)以及下調(diào)的基因和RNA-seq結(jié)果一致（fig5B、C）。在這些變化的基因中，SERPINB2是circPSD3過表達(dá)引起最大上調(diào)的基因。uPA系統(tǒng)在ECM和基底膜的降解中起著關(guān)鍵作用，SERPINB2 與uPA相互作用，誘導(dǎo)內(nèi)吞uPA-uPAR復(fù)合物。為了進(jìn)一步確定circPSD3在SERPINB2的表達(dá)中的調(diào)節(jié)作用，在HCC細(xì)胞中SERPINB2穩(wěn)定表達(dá)同時(shí)circPSD3被敲低。這些結(jié)果表明circPSD3被刪除會降低HCC細(xì)胞中SERPINB2的表達(dá)（fig5D、E）。circPSD3對于SERPINB2以及uPA系統(tǒng)其他組分的調(diào)節(jié)作用被WB驗(yàn)證（fig5F）。這些結(jié)果表明SERPINB2和它調(diào)節(jié)的uPA系統(tǒng)是circPSD3的下游。
為了探究Upa系統(tǒng)在HCC進(jìn)程中的作用，SERPINB2，uPA和uPAR的mRNA通過qpcr檢測，結(jié)果表明SERPINB2顯著下調(diào)，uPA和uPAR顯著上調(diào)（fig5G、I）。Pearson相關(guān)性表明在HCC組織中，SERPINB2的表達(dá)和circPSD3呈正相關(guān)（fig5J），加強(qiáng)了SERPINB2和circPSD3的相關(guān)性。免疫組化表明在非腫瘤的HCC和PVTT中SERPINB2逐漸減少，但是在uPAR中觀察到一個(gè)相反的趨勢（fig5K）顯示了uPA促進(jìn)HCC中的血管侵襲的潛在作用。體內(nèi)的研究表明SERPINB2的敲除可以顯著促進(jìn)HCC的遷移和侵襲。WX-671，作為uPA系統(tǒng)的抑制劑，顯著降低被circPSD3敲除所引起的細(xì)胞的遷移和侵襲（fig5L、M）。這些結(jié)果都表明，SERPINB2以及它所調(diào)節(jié)的uPA系統(tǒng)會抑制在HCC細(xì)胞遷移和侵襲中circPSD3的調(diào)節(jié)作用。
circPSD3直接和HDAC1結(jié)合
蛋白質(zhì)之間的相互作用在circRNA的功能上也發(fā)揮著重要的作用。在之前的研究中，circRNA相互聯(lián)系的蛋白通過RNA-pulldown通過生物素標(biāo)記識別，針對circRNA的接頭處。然而，由于在接頭處GC的含量太高，針對circPSD3設(shè)計(jì)一個(gè)探針比較困難。所以，研究人員使用了一個(gè)MS2-標(biāo)記的TRAP來識別和circPSD3結(jié)合的蛋白質(zhì)。CircPSD3-MS2和GST-MS2載體一起轉(zhuǎn)染進(jìn)HCC-LM9細(xì)胞。circPSD3潛在結(jié)合的蛋白通過GST抗體檢測（fig6A）。接下來通過LC-MS識別了145個(gè)蛋白，這些蛋白在circPSD3-MS2中富集，其中16個(gè)有超過三個(gè)獨(dú)特的肽段（fig6C）。
circPSD3對于SERPINB2有調(diào)節(jié)作用，影響它的mRNA和蛋白水平。除此之外，RNA-seq結(jié)果表明circPSD3顯著上調(diào)SERPINB10的mRNA水平，是SERPINB2的下游。因此，研究人員推測circPSD3和一個(gè)調(diào)節(jié)SERPINB2的蛋白結(jié)合。在circPSD3-MS2富集的蛋白中，HDAC1是組蛋白去乙酰化酶家族的成員，通過組蛋白去乙酰化參與轉(zhuǎn)錄抑制（fig6D）。TRAP檢測表明circPSD3 和 HDAC1 之間的相互作用（圖 6E）。RIP試驗(yàn)也表明，HCC 細(xì)胞中的 circPSD3 在HCC細(xì)胞中被 HDAC1 沉淀（圖 6F）。FISH 和 IF 分析顯示，內(nèi)源性 circPSD3 和 HDAC1 在 HCC 細(xì)胞胞質(zhì)中的共定位（圖 6G）研究結(jié)果表明HDAC1敲低顯著上調(diào)了在HCC細(xì)胞中SERPINB2的表達(dá)（fig6H）。因此，研究人員將HDAC1作為circPSD3結(jié)合的蛋白。隨后，研究人員試圖確定 HDAC1 與 circPSD3 相互作用的區(qū)域。根據(jù) catRAPID，HDAC1 的 376-427 氨基酸序列是最有可能與 circPSD3 發(fā)生相互作用的部位。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，研究人員構(gòu)建了野生型和一組截短的 HDAC1 突變質(zhì)粒，每個(gè)質(zhì)粒都在 NH2 末端標(biāo)記了三份 FLAG（3 ×FLAG）（圖 6I）。這些載體在 HEK-293T 細(xì)胞中成功表達(dá)（圖 6J）。RIP 實(shí)驗(yàn)表明，刪除 HDAC1 的 376-427 氨基酸序列會取消 HDAC1 與 circPSD3 之間的相互作用。
circPSD3抑制uPA系統(tǒng)
鑒于uPA系統(tǒng)在促進(jìn)多種惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移方面發(fā)揮作用，所以被作為是癌癥的潛在治療策略。研究表明，人工過表達(dá)circPSD3可能是抑制uPA系統(tǒng)的一種新方法。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，上調(diào)uPAR的表達(dá)，以模擬活化的uPA系統(tǒng)。傷口愈合和 Transwell 試驗(yàn)表明，uPAR 過表達(dá)會明顯增加 HCC 細(xì)胞的遷移和侵襲（圖 7A）。這種效應(yīng)被circPSD3的過表達(dá)所消除（圖 7D、E）。這些結(jié)果在肺轉(zhuǎn)移和肝臟原位植入和肝臟正位植入模型進(jìn)一步證實(shí)。在這些模型中，circPSD3的共表達(dá)明顯減輕了肺轉(zhuǎn)移病灶和肝內(nèi)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)（圖 7F、G）。然而體外合成的 circPSD3 對腫瘤血管侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用對 HCC 血管侵襲和轉(zhuǎn)移的抑制作用還需要進(jìn)一步研究。
討論：
circPSD3 是一種參與侵襲和轉(zhuǎn)移的 circRNA轉(zhuǎn)移。腫瘤組織中 circPSD3 的減少預(yù)示著部分肝切除術(shù)后的HCC患者預(yù)后不佳。TDP43有助于circPSD3的生物生成。從機(jī)制上講，circPSD3與HDAC1 相互作用，將 HDAC1 封閉在細(xì)胞質(zhì)中，從而釋放 HDAC1 的轉(zhuǎn)錄抑制作用。HDAC1 對 SERPINB2 的轉(zhuǎn)錄抑制作用。升高的 SERPINB2 會抑制uPA系統(tǒng)，并介導(dǎo)的抑制作用（圖 8）。
本研究中，使用了吉凱生產(chǎn)的過表達(dá)慢病毒過表達(dá)circPSD3和uPAR
參考文獻(xiàn)：
Liangliang Xu1, et al., circPSD3 is a promising inhibitor of uPA system to inhibit vascular invasion and metastasis in hepatocellular carcinoma. Molecular Cancer, 2023.Oct 26;22(1):174.