??Calcein AM，中文名鈣黃綠素乙酰氧基甲酯，是一種可滲透進入細胞、常用于測定真核細胞活力或線粒體通透性轉換孔(Mitochondrial Permeability Transition Pore, MPTP)的綠色熒光探針。Calcein AM近年來被廣泛應用到細胞活性分析實驗中。
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流式細胞儀 |
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Ex: |
532/561 nm |
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Em： |
585/40? ?nm? |
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熒光顯微鏡
Ex:????????????TRITC 濾波片組
Em：???????????TRITC 濾波片組
推薦孔板:?????????黑色透明底板
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熒光酶標儀
Ex:?????????????540 nm
Em：????????????590 nm
Cutoff：? ? ? ? ? ? ?570 nm
推薦孔板:? ? ? ? ? ??黑色透明底板
讀取模式：? ? ? ? ? ??底讀模式
實驗方案：
操作步驟
1.準備HHBS緩沖液，10％Pluronic?F-127溶液和25 mM Probenecid溶液。
2.在高質量無水DMSO中制備2 mM至5 mM Calcein Red AM原液。
2.1使用Calcein Red AM的量：1毫克
2.2所需濃度：2 mM
2.3在合適的容器中，將1mg Calcein Red TM AM與492.23μL無水DMSO混合。
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3.使用10μMCalceinRed AM 4在HHBS中制備2X工作溶液，0.08％Pluronic?F-127和2 mM丙磺舒。
3.1終孔內濃度的Calcein Red AM：5μM
3.2Pluronic?F-127的終井內濃度：0.04％
3.3終孔內濃度的丙磺舒：1mM
3.4在合適的容器中，混合16μL的Calcein Red AM，25.6μL的10％Pluronic F-127和256μL的25mM丙磺舒。然后，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為3.2 mL。
注意：對于大多數細胞系，我們建議Calcein Red AM的終濃度為4至5μM。
注意：推薦的Pluronic F-127孔濃度終為0.02％至0.04％。
注意：推薦的終濃度為1至2.5 mM的Probenecid。
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4.將100μL染料工作溶液加入已經含有100μL培養基的所需孔中。
4.1該步驟將染料工作溶液從2X稀釋至1X，并將每種組分的終濃度調節至以下：5μM的Calcein Red AM，0.04％Pluronic F-127,1mM丙磺舒。
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5.孵育染料
5.1將染料加載板在細胞培養箱中孵育20-60分鐘。
5.2將染料加載板在室溫下孵育30分鐘。
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6.用1.0 mM Probenecid準備HHBS緩沖液（或您選擇的緩沖液）。
6.1在合適的容器中加入160μL的25mM丙磺舒。然后，添加HHBS或您選擇的緩沖液，直到體積為4 mL。
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7.用HHBS緩沖液或您選擇的緩沖液替換染料工作溶液，使用1.0 mM Probenecid。
7.1首先，從所需孔中除去200μL染料工作溶液和培養基。
7.2在相同的孔中加入200μL含有1.0mM丙磺舒的HHBS（或您選擇的緩沖液）。
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8.運行實驗
8.1為您的樣品添加所需的處理。
8.2以Ex / Em = 560/574 nm運行實驗
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圖1所示。海拉細胞生活的照片沾鈣黃綠素紅TM, (Cat.21900)。細胞核染色了赫斯特33342年(藍色, 17535)。
圖2。海拉細胞彩色圖像用鈣黃綠素紅?。左:活海拉細胞;右:固定的海拉細胞。