結直腸癌 (Colorectal cancer, CRC) 在惡性腫瘤中發病率排第三，死亡率占據第二位，并且CRC肝轉移（CRCLM）的死亡率超過70%。目前常用于治療CRCLM的藥物是血管生成抑制劑貝伐單抗，然而，經常出現先天性或獲得性耐藥導致治療失敗和癌癥復發。已有研究證明CRCLM能夠通過血管劫持（vessel co-option）過程產生耐藥，血管劫持過程指的是隨著時間的推移，腫瘤可學會“劫持”周圍組織的正常血管對藥物產生耐藥性，不過針對血管劫持機制的研究主要集中“劫持者”腫瘤細胞方向，而“被劫持者”竇狀毛細血管方向的作用機制還尚未探索。組學技術的快速發展和應用為復雜疾病的機制探究提供了便利，技術的革新更是將人類健康和疾病的研究推上了新的臺階。
2022年8月，來自暨南大學陳敏鋒、葉文才及張冬梅共同通訊在Journal of Clinical Investigation （IF=19）在線發表題為《Targeting FAPα-expressing hepatic stellate cells overcomes resistance to anti-angiogenics in colorectal cancer liver metastasis models》的研究成果，該研究整合轉錄組學和蛋白質組學技術深度解析了靶向表達FAPα的肝星狀細胞可以克服結直腸癌肝轉移模型中抗血管生成藥物的耐藥性的分子機制。該研究發現貝伐單抗耐藥的腫瘤細胞成纖維細胞生長因子結合蛋白 1 (FGFBP1)上調表達，FGFBP1通過增強HSCs旁分泌FGF2-FGFR1-ERK1/2EGR1信號通路誘導FAPα表達，FAPα促進肝星狀細胞（HSC）中CXCL5的分泌，從而激活CXCR2以促進腫瘤細胞的上皮-間質轉化和募集骨髓來源的抑制細胞產生耐，通過靶向FAPα+ HSC能夠有效的破壞竇狀毛細血管的選定和克服貝伐單抗耐藥性。中科新生命為其提供了轉錄組學和TMT蛋白質組學技術服務。
2022年8月，來自暨南大學陳敏鋒、葉文才及張冬梅共同通訊在Journal of Clinical Investigation （IF=19）在線發表題為《Targeting FAPα-expressing hepatic stellate cells overcomes resistance to anti-angiogenics in colorectal cancer liver metastasis models》的研究成果，該研究整合轉錄組學和蛋白質組學技術深度解析了靶向表達FAPα的肝星狀細胞可以克服結直腸癌肝轉移模型中抗血管生成藥物的耐藥性的分子機制。該研究發現貝伐單抗耐藥的腫瘤細胞成纖維細胞生長因子結合蛋白 1 (FGFBP1)上調表達，FGFBP1通過增強HSCs旁分泌FGF2-FGFR1-ERK1/2EGR1信號通路誘導FAPα表達，FAPα促進肝星狀細胞（HSC）中CXCL5的分泌，從而激活CXCR2以促進腫瘤細胞的上皮-間質轉化和募集骨髓來源的抑制細胞產生耐，通過靶向FAPα+ HSC能夠有效的破壞竇狀毛細血管的選定和克服貝伐單抗耐藥性。中科新生命為其提供了轉錄組學和TMT蛋白質組學技術服務。
研究材料
人結直腸癌肝轉移組織標本；結腸直腸癌細胞系；小鼠
技術路線
步驟1：貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型中血管選定的數量和FAPα蛋白的表達水平
步驟2：條件性敲除HSCs中FAPα基后探究影響血管選定過程原因
步驟3：研究FAPα對MDSC的招募和腫瘤轉移的影響
步驟4：探究FAPα促進血管選定的分子機制
步驟5：闡明結直腸癌肝轉移患者貝伐單抗耐藥的分子機制
結果部分：
人結直腸癌肝轉移組織標本；結腸直腸癌細胞系；小鼠
技術路線
步驟1：貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型中血管選定的數量和FAPα蛋白的表達水平
步驟2：條件性敲除HSCs中FAPα基后探究影響血管選定過程原因
步驟3：研究FAPα對MDSC的招募和腫瘤轉移的影響
步驟4：探究FAPα促進血管選定的分子機制
步驟5：闡明結直腸癌肝轉移患者貝伐單抗耐藥的分子機制
結果部分：
- 貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植模型中血管選定的數量和HSCs中FAPα基因的表達水平均升高
研究者通過異種移植貝伐單抗敏感的HCT116細胞到小鼠肝臟，然后使用10mg/kg的貝伐單抗處理42天產生耐藥模型，使用貝伐單抗耐藥的細胞HT-29作為對照組（Fig1 A）。結果發現，在貝伐單抗耐藥組的病理學生長模式以RHGP為主要模式(Fig1 B)，并且免疫熒光結果顯示貝伐單抗獲得性耐藥的HCT116 CRCLM異種移植模型中發生血管選定（CD31+）的數量更多(Fig1 C)。通過進一步針對貝伐單抗耐藥組中出現血管選定的血管特征進行分析發現，FAPα蛋白主要在αSMA+ HSCs表達，而在對照組中無表達(Fig1 D)。這些結果提示結直腸癌肝轉移中血管選定導致貝伐單抗耐藥可能與HSCs中FAPα的表達有關。
- FAPα誘導HSCs分泌CXCL5促進血管選定
研究者接下來探索了FAPα在HSCs中對血管選定的作用。結果顯示，FAPα條件性敲除后血管選定的數量減少(Fig2 C)，GR-1+髓源性抑制性細胞的募集明顯受到抑制(Fig2 D)，CD8+T細胞的數量明顯升高(Fig2 E)，FAPα條件性敲除后RT-PCR結果顯示間充質細胞標志蛋白vimentin和N-cadherin的表達水平顯著下調，上皮細胞標志蛋白E-cadherin顯著上調，因此推測FAPα+HSCs可能是通過預先建立免疫抑制生態位，誘導腫瘤細胞EMT促進血管選定。
轉錄組測序結果顯示，FAPα基因過表達的肝星狀細胞系中分泌的細胞因子CSF2, IL18, CXCL5, IL33, IL1B以及 IL16的表達水平上調(Fig3 A)，并且通過RT-PCR對上述基因進行驗證，結果顯示IL18,CXCL5, IL33和IL1B與測序結果相符，并且CXCL5基因的表達水平升高的最為顯著(Fig3 B)；ELISA結果顯示在FAPα基因過表達的細胞系的培養基上清中CXCL5的含量也升高(Fig3 C)；結果提示FAPα可能與HSCs分泌CXCL5有關。因為腫瘤來源的CXCL5能夠通過激活CXCR2促進腫瘤細胞EMT和MDSC募集，因此研究者推測HSCs來源的FAPα可能通過CXCL5-CXCR2軸促進腫瘤細胞EMT和MDSC的募集，并最終通過一系列實驗驗證了猜想：FAPα誘導HSCs分泌CXCL5細胞因子激活CXCR2促進腫瘤細胞EMT和MDSC募集，從而促進血管選定。
3.腫瘤細胞源性FGFBP1能夠誘導HSCs表達FAPα促進血管選定
為探討HSCs表達FAPα促進血管選定的分子機制，研究者運用蛋白質組學方法對貝伐株單抗敏感和耐藥的HCT116 CRCLM異種移植腫瘤進行了分析，結果顯示在貝伐單抗耐藥的腫瘤中檢測到17個上調表達的蛋白(Fig4 A)，并且通過RT-PCR確認FGFBP1基因表達水平也最為顯著(SFig4 A&B)。免疫組化染色、Western blotting和ELISA檢測顯示，在貝伐單抗耐藥的CRCLM異種移植體系（HCT116和HT-29）的腫瘤組織和原代細胞中FGFBP1均高表達(Fig4 B-D)。為探討FGFBP1對HSCs中FAPα表達和血管選定的作用機制，在HCT116細胞上構建了FGFBP1基因過表達細胞系，在HT-29細胞上構建了FGFBP1基因干擾表達細胞系，HE染色結果顯示過表達FGFBP1后RHGP的比率顯著升高，相反，干擾FGFBP1的表達之后RHGP的比率顯著降低(Fig4 E)。同時，在免疫熒光結果中過表達FGFBP1后血管選定的數量和陽性表達FAPα蛋白的HSCs數量也顯著增多，干擾之后數量就會減少(Fig4 F，G)。
4、FGFBP1能夠通過FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1軸誘導HSCs表達FAPα蛋白
接下來，研究者針對FGFBP1誘導HSCs表達FAPα蛋白的機制展開探索，由于FGFBP1能夠通過細胞外基質（ECM）釋放FGF2來增強FGFR1信號通路，所以研究者檢測了LX-2細胞系中FGF2和FGFR1的基因表達水平，發現其確實高于其他的FGFs和FGFRs（sFig6 A，B）。另外，FGF2和磷酸化的FGFR1在陽性表達FAPα蛋白的HSCs中表達水平升高（sFig6 C），說明FGFBP1可能是通過FGF2-FGFR1信號通路來誘導HSCs表達FAPα蛋白的。鑒于ERK1/2-EGR1軸位于FGFR1的下游，而EGR1能夠與FAP基因的啟動子結合誘導FAPα的表達，所以研究者認為FGFR1激活誘導HSCs中FAPα的表達可能受ERK1/2-ERG1軸的調控。因此研究者就通過WB檢測了FGFR1和ERK1/2的磷酸化狀態以及EGR1和FAPα的表達水平，發現FGFBP1過表達之后這些標志蛋白的表達水平均顯著上調（Fig5 A）。此外，敲除RGR1基因后FAPα的表達水平顯著下調（Fig5 D），進一步對研究的猜想進行了驗證。
緊接著，研究者通過一系列的細胞培養和分子生物學方法，進一步探究了FGF2-FGFR1-FAPα途徑在促進貝伐單抗誘導的血管選定的作用后發現，FGFR1的激活可能是依賴于FAPα誘導HSCs分泌趨化因子CXCL5促進腫瘤細胞的EMT和MDSC招募，從而促進血管選定過程。并且這一結果也在臨床結直腸癌肝轉移的標本中進行了驗證，此外，該研究的最后使用了研究者實驗室合成FAPα活化的前體藥物Z-GP-DAVLBH，數據表明Z-gp-DAVLBH能選擇性誘導FAPα+HSCs細胞凋亡，擾亂血管選定，克服血管選定介導的貝伐單抗單抗治療耐藥。
總結
本文通過運用轉錄組學和蛋白質組學技術進行前期數據探索性挖掘，并結合細胞和分子生物學技術揭示了貝伐單抗耐藥的腫瘤細胞高表達FGFBP1 ，并通過FGFBP1-FGF2-FGFR1-ERK1/2-EGR1通路誘導HSCs中FAPα蛋白的表達，FAPα進而促進HSCs中CXCL5的分泌后激活CXCR2來增強MDSC的浸潤和腫瘤細胞EMT，最終促進血管選定。此外，用FAPα激活的前藥物Z-GP-DAVLBH靶向FAPα+HSCs有效地克服了血管選定介導的CRCLM對抗血管生成治療的耐藥性，提供了潛在的治療策略和藥物候選。