口腔鱗狀細胞癌(OSCC)是最常見的口腔惡性腫瘤，其轉移是患者預后差的主要原因。自噬可通過減輕各種細胞應激促進OSCC的發展。然而，自噬在OSCC細胞增殖和轉移中的作用機制尚不清楚。
2022年4月25日，上海交通大學張志愿教授團隊、浙江大學周舟教授團隊和陸軍軍醫大學皮會豐教授團隊合作在Signal Transduction and Targeted Therapy（IF 18.187）上發表了題為“NUPR1 promotes the proliferation and metastasis of oral squamous cell carcinoma cells by activating TFE3-dependent autophagy”的研究論文，該研究使用Labelfree定量蛋白組學方法分析顯示，核蛋白 1 (NUPR1) 是有或無淋巴轉移OSCC患者的福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)腫瘤樣本中最顯著上調的蛋白，NUPR1 在 OSCC 組織中異常表達，可能與 OSCC 患者的總體存活率較低。此外該研究使用TMT標記定量蛋白組學方法分析顯示NUPR1通過直接增加轉錄因子E3 (TFE3)活性來維持自噬流和溶酶體功能，進而促進 OSCC 細胞增殖和體內外轉移。本研究中NUPR1-TFE3介導的自噬過程為靶向OSCC進展的藥物治療提供了潛在的治療靶點。中科新生命為本研究提供了Labelfree非標記定量蛋白組學和TMT標記定量蛋白組學的技術支持。
研究材料
有和無淋巴轉移的OSCC的FFPE樣本、Cal27和HN6癌細胞系、OSCC組織和正常粘膜組織
技術路線
1. Labelfree蛋白組學分析發現NUPR1在有淋巴轉移的OSCC的FFPE樣本中顯著上調
作者首先對來自有淋巴轉移（LNM）和沒有淋巴轉移(non-LNM)的OSCC患者的FFPE腫瘤樣本（分別為10個樣本）進行了Labelfree非標記定量蛋白組學分析（圖1a）。此次共鑒定到3021個蛋白，LNM vs non-LNM組的比較分析顯示208個蛋白顯著上調，其中NUPR1蛋白是上調倍數前五的蛋白（圖1c）。
圖1 Labelfree非標記定量蛋白組學分析
2. NUPR1與患者的OSCC進展及不良預后呈正相關
為驗證蛋白組學的結果，作者采用IHC的方法進行了NUPR1的組織芯片（TMA）實驗，結果表明NUPR1表達水平在OSCC組織中(n = 88)相較于正常粘膜組織(n = 20) 顯著增加（圖2a和2c）。NUPR1表達水平與臨床病理特征的關聯分析表明NUPR1與OSCC轉移呈正相關（圖2b、2d和2e）。此外，Kaplan-Meier生存分析顯示NUPR1高表達的OSCC患者總生存率較低(圖2f)。
為了進一步闡明NUPR1在OSCC進展中的作用，作者在高表達NUPR1的OSCC細胞系（Cal27和HN6癌細胞系）中將NUPR1敲除。集落形成實驗顯示，NUPR1敲低后顯著降低了OSCC癌細胞的集落形成效率（圖2g）。傷口愈合和Transwell侵襲實驗結果表明NUPR1敲低的癌細胞遷移和侵襲能力明顯受到抑制（圖2h-2j）。綜上所述，NUPR1 敲低有效地抑制了OSCC的進展，表明了NUPR1與OSCC的進展的正相關性。
圖2 NUPR1與OSCC進展及不良預后呈正相關
3. 蛋白組學揭示自噬在NUPR1介導的OSCC進展中發揮重要作用
為了揭示NUPR1在OSCC進展中的潛在機制，作者采用TMT標記定量蛋白組學的方法檢測了NUPR1敲低的Cal27癌細胞和對照組細胞間的蛋白變化。比較分析顯示與對照組相比，NUPR1敲低的Cal27癌細胞中27個蛋白顯著上調、28個蛋白顯著下調（圖3a）。差異蛋白的KEGG通路富集分析表明，自噬通路顯著富集(圖3b)，這意味著自噬可能在NUPR1介導的OSCC進展中發揮重要作用。
圖3 自噬在NUPR1介導的OSCC進展中發揮重要作用
4. NUPR1的敲低阻斷了OSCC細胞中的自噬流
為驗證NUPR1的敲低是否影響OSCC細胞中的自噬流，作者分析了自噬體形成的標志物MAP1LC3B-II（微管相關蛋白輕鏈3）的變化，結果顯示在Cal27和HN6癌細胞將NUPR1敲低后，MAP1LC3B-II表達水平均增加（圖4a和4b），以及SQSTM1（選擇性自噬接頭蛋白）的表達水平也明顯增加（圖4a和4b）。然而在癌細胞中將NUPR1敲低同時加入氯喹(CQ)（自噬以及自噬流的抑制劑）時，NUPR1敲低誘導的MAP1LC3B-II的表達增加不受影響(圖4c和4d)。綜上所述，在OSCC細胞中，NUPR1的敲低可抑制自噬流。
圖4 NUPR1的敲低阻斷了OSCC細胞中的自噬流
5. NUPR1的敲低不抑制OSCC細胞自噬體的形成和成熟
由于自噬是一個動態循環系統，具有多個步驟（①自噬泡的形成②Atg5-Atg12-Atg16L復合物形成并與自噬泡融合③微管相關蛋白輕鏈3（LC3）與自噬泡結合形成自噬體④自噬體捕獲需降解或清除的蛋白質等物質⑤自噬體與溶酶體結合形成自噬溶酶體、內容物降解），作者進一步研究了NUPR1敲低在早期或晚期誘導的自噬抑制作用。研究發現ATG5 沉默降低了NUPR1敲低誘導的Cal27和HN6細胞GFP-LC3（自噬體的特異性標記物）的增加（圖5a和5b），也降低了MAP1LC3B-II的積累（圖5c和5d），表明NUPR1的敲除不影響自噬體的形成。多泛素蛋白聚集物是成熟自噬體的重要組成部分，其形成是由SQSTM1介導的，作者通過評估GFP-LC3與SQSTM1的共定位來評估自噬小體的成熟。結果表明NUPR1的敲低并不促進OSCC細胞中自噬體的成熟（圖5e和5f）。
圖5 NUPR1的敲低不抑制OSCC細胞自噬體的形成和成熟
6. NUPR1敲低不影響OSCC細胞中的自噬體-溶酶體的融合
自噬體與溶酶體的融合是自噬降解的一個基本過程，研究發現在Cal27和HN6細胞中，自噬體標記物GFP-LC3和溶酶體標記物LAMP2的共定位比例不受NUPR1敲低的影響（圖6）。
圖6 NUPR1敲低不影響OSCC細胞中的自噬體-溶酶體的融合
7. NUPR1的敲低抑制了OSCC細胞中溶酶體的功能
為了研究NUPR1的敲低是否抑制了溶酶體的功能，作者檢測了溶酶體標志物LAMP1和LAMP2的表達水平。結果表明，在Cal27和HN6細胞中，NUPR1的敲低抑制了LAMP1的表達，但不抑制LAMP2 (圖7e和7f)。此外，在NUPR1敲低的OSCC細胞中，溶酶體蛋白水解活性明顯受到抑制(圖7g)、溶酶體綠色熒光探針的熒光強度也顯著降低（圖7h）。綜上所述NUPR1敲低對自噬流的阻斷可能是通過抑制OSCC細胞內溶酶體功能來介導的。
圖7 NUPR1的敲低抑制了OSCC細胞中溶酶體的功能
8. TFE3負責OSCC細胞中NUPR1介導的自噬溶酶體過程
為了闡明NUPR1影響自噬溶酶體的潛在機制，作者使用蛋白質組學方法分析NUPR1敲低的Cal27細胞和對照組的顯著差異蛋白，結果表明NUPR1的敲低顯著降低了TFE3的表達水平，western blot實驗進一步驗證了該結果（圖8a和8b），PCR實驗也證實了自噬流中涉及的“TFE3應答基因”的表達變化（圖8c和8d），綜上表明NUPR1在自噬溶酶體事件中發揮的關鍵作用可能與TFE3有關。
已知NUPR1是調控基因轉錄的重要轉錄因子，故作者采用熒光素酶報告基因的方法檢測NUPR1與TFE3的關系，結果表明在OSCC進展中，NUPR1是通過增加TFE3啟動子活性和激活TFE3轉錄來維持自噬流的（圖8e和8f）。
圖8 NUPR1在自噬溶酶體事件中發揮的關鍵作用與TFE3有關
此外， TFE3的過表達可以顯著挽救NUPR1敲低對Cal27和HN6細胞溶酶體功能的損傷（圖9a-9d）,也顯著降低了NUPR1缺失的OSCC細胞中MAP1LC3B-II和SQSTM1的積累(圖9e和9f)。
圖9 TFE3過表達可挽救OSCC細胞中NUPR1 減少引起的自噬流的抑制
9. 在體外和體內，NUPR1通過激活TFE3依賴的自噬促進OSCC的進展
為了探究TFE3在NUPR1敲低介導的OSCC細胞進展中的影響，作者展開了一系列的體外實驗，結果表明TFE3的過表達部分逆轉了NUPR1 敲低介導的OSCC細胞遷移和侵襲的抑制作用(圖10a-f)。
圖10 TFE3的過表達可拮抗NUPR1 敲低誘導的OSCC細胞增殖和轉移抑制
此外，體內實驗發現NUPR1敲低導致接種于裸鼠皮下的Cal27細胞形成的腫瘤的體積和重量明顯減少（圖11a-11c）。也導致了轉移性結節形成和生長的抑制（圖11d）。同時，NUPR1敲低有效地抑制了異種移植瘤模型中TFE3和“TFE3應答基因”的表達(圖11e)。在對轉移性結節的評估中也得到了同樣的結果（圖11f）。綜上所述，NUPR1敲低對OSCC進展的抑制依賴于TFE3活性的抑制。
圖11 NUPR1的敲除抑制了裸鼠OSCC的侵襲性
小編小結
在本研究中，作者首次證明了(Ⅰ)通過對有淋巴結轉移和無淋巴結轉移的口腔鱗狀細胞癌 (OSCC)組織FFPE樣本的蛋白組學分析發現了NUPR1是一種關鍵蛋白，在LNM患者中顯著增強，且與OSCC轉移和不良預后呈正相關。(Ⅱ)溶酶體功能障礙而非其他關鍵步驟的破壞(自噬體形成或成熟，自噬體-溶酶體融合)是NUPR1 敲低誘導的自噬流受損和OSCC細胞增殖和轉移抑制的關鍵原因。(Ⅲ)在OSCC進展中，NUPR1通過增加TFE3啟動子活性和激活TFE3轉錄來維持自噬流。這些發現為細胞癌進展中NUPR1-TFE3依賴的自噬的潛在治療靶點拓寬了新的見解。
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