編者按
心臟的作用是推動血液流動，向器官、組織提供充足的血流量，以供應氧和各種營養物質，并帶走代謝的終產物，使細胞維持正常的代謝和功能。體內各種內分泌的激素和一些其它體液因素，也要通過血液循環將它們運送到靶細胞，實現機體的體液調節，維持機體內環境的相對恒定。
今天，我們特別關注一項于2022年3月發表在《Nature Communications》（IF：16.6）的經典研究——Human multilineage pro-epicardium/foregut organoids support the development of an epicardium/myocardium organoid，該研究報告了人類多譜系前心外膜/前腸類器官對心外膜/心肌類器官發育的影響。
01、研究背景
人類多能干細胞（hPSCs）及其分化成不同細胞類型的能力在過去幾年中得到了深入的探索，其中主要包括開發多種器官的體外模型。具體來說，通過生成hPSC衍生的類器官，體外重現胚胎發育已經在多個組織中取得成功，包括大腦、腸道和腎臟。然而，在體外再現心臟早期發育階段尤其具有挑戰性，只有少數最新研究在一定程度上再現了心臟發生過程中的結構組織。
對心臟胚胎發育至關重要的一個結構是前心外膜（PE）。前心外膜是一種源自側板中胚層（LPM）的瞬時結構，這一瞬時結構由心外膜祖細胞組成，這些祖細胞向發育中的心臟遷移，形成覆蓋心肌的外上皮層——心外膜。心外膜不僅是支持和促進心肌功能性結締組織形成的心臟成纖維細胞的主要來源，還是冠狀動脈平滑肌細胞的主要來源，對冠狀動脈血管的發育至關重要。此外，除了作為心臟細胞的祖細胞來源外，心外膜還能釋放旁分泌信號，這些信號對誘導發育中心肌的增殖和成熟至關重要。
本文作者建立了一個人類多譜系類器官模型，它再現了前心外膜、橫隔間充質和肝芽的共同發生。此外，作者還研究了WNT、BMP和視黃酸信號調控對多譜系類器官的影響。通過將這些類器官與心肌細胞球共同培養，研究人員生成了一個自組織的心臟類器官，包括一個完全包圍心肌樣組織的心外膜樣層。這些心臟類器官模型再現了心外膜細胞對促進心肌細胞增殖以及結構和功能的影響，進一步體現心臟形成過程中心肌與心外膜的相互作用。
02、主要研究成果
1、PE聚合體在類似體內環境中再現前心外膜結構
研究人員評估了參與形成心肌細胞（CMs）和PE的重要基因表達的動態變化。結果顯示，PE誘導后，心肌祖細胞的標志物 NKX2.5和ISL1的表達水平立即下降，而PE標志物WT1、TBX18、ALDH1A2和TCF21則明顯上調。在本模型中，兩種分化方案均觀察到TBX5的表達隨時間推移而增加，但PE分化方案的表達水平高于CM分化方案。GATA4的表達在兩種方案的最初幾天都有明顯增加，到Day11時，與CM相比，PE中的GATA4表達水平更高。
為了更詳細地了解細胞的組成并判定是否存在結構組織，研究人員用免疫熒光（IF）染色法對PE切片進行了分析。其證實了Day11時PE中存在LHX2+細胞，上皮結構周圍的細胞染色更明顯，而外圍則沒有或表達較少，WT1染色更明顯。這一觀察結果表明，WT1+細胞至少包括兩種不同的細胞群，一種是WT1+/LHX2-/+low的PE樣細胞群，定位于外圍；另一種是WT1+low/LHX2+的橫膈間充質（STM）樣細胞群，定位于PE區域和上皮腔之間。
原文圖1 PE/STM/PFH類器官再現前心外膜、橫隔、后前腸和肝上皮芽的胚胎結構
2、雙相WNT調節產生內胚層和中胚層祖細胞
研究人員通過流式細胞術分析CXCR4和c-KIT以及其他中胚層標志物KDR和PDGFRA，確定了祖細胞的不同亞群。在分化的Day5階段，24±4%的細胞為CXCR4+/c-KIT+/KDR-/PDGFRA-，這意味著在這個時間點，聚集體中存在明確的內胚層（DE）祖細胞。
此外，分析細胞中有±5%是CXCR4-/c-KIT+/KDR+high的血管祖細胞。其余細胞為CXCR4+/c-KIT-/KDR+low/PDGFRA+，代表中胚層附屬細胞群，占細胞總數的80±4%。
通過IF染色進一步分析發現，其存在中胚層（ISL1+）、內胚層（SOX17+）和血管細胞（CD34+）。PE/STM/PFH類器官來源于中胚層和內胚層祖細胞群，它們是在三維條件下通過對WNT信號進行時間調控而產生的。
原文圖2 由內胚層和中胚層祖細胞組成的細胞群（Day5 hPSC分化出的聚合體）
3、WNT和RA對PE/STM/PFH類器官的發育至關重要
研究人員通過流式細胞術以及IF染色分析發現，WNT和RA是PE/STM/PFH器官形成的關鍵因素；抑制RA通路的激活會導致肝芽器官的形成；在分化的Day5和Day7之間去除WNT信號的激活可使CM和PE/STM細胞群共同出現。
原文圖3 WNT和RA是PE/STM/PFH類器官發育的關鍵信號
4、三維PE/STM/PFH細胞與CM共培養再現心外膜與心肌的相互作用
研究人員發現，在三維環境中將CMs與PE/STM/PFH細胞共培養，可啟動細胞自組織過程，生成包含WT1+心外膜樣層包圍cTnT+心肌樣組織的類器官。
通過分析顯示，這些EMOs重現了以前與體內心外膜作用相關的重要過程，如心肌增殖和成熟等。此外，MZ中也存在CD31+細胞網絡，表明EMOs中重現了冠狀血管的形成。
原文圖4 PE/STM/PFH細胞與CMs共培養后形成的心臟類器官模型
5、WNT/BMP聯合激活可增強后SHF/臟壁中胚層的分化
在hiPSCs分化的Day1和Day3階段，BMP和WNT的聯合激活可能會誘導RA通路的上調，從而產生早期軸旁中胚層祖細胞亞群，進而推動LPM祖細胞群從心臟中胚層向第二心場（SHF）/臟壁中胚層的分化。
WNT和BMP4信號通路在Day1-Day3分化期間的激活會影響CM的形成，但不會影響PE/STM的產生，而且WB條件下內胚層祖細胞的減少也會影響PE/STM/PFH類器官中上皮-前腸結構的發育。此外，研究結果表明，與在Day5進行WNT和BMP信號通路聯合激活（WB）誘導PE/STM相比，從Day3 WB開始的PE/STM誘導更有利于形成類器官。
原文圖5 WNT和BMP信號通路的長期聯合激活通過RA信號激活誘導后第二心場（SHF）/臟壁中胚層的分化
03、編者點評
本文的研究結果凸顯了多譜系PE/STM/PFH類器官模型的潛力，可用于研究人類PE/STM胚胎發生機制以及通過信號通路的組合調控實現肝實質和非實質細胞特化。此外，EMOs的生成簡單且可重復，可呈現連續的心外膜樣細胞層和模式化的血管樣網絡，為研究和模擬體外心外膜-心肌相互作用開辟了一條新的道路。這可進一步用于模擬先天性心臟病（CHD）的探索，如冠狀動脈血管疾病和心肌非壓迫性心肌病，以及作為胚胎心臟發育過程中的藥物篩選和毒理學檢測模型。
這是一項非常值得閱讀的類器官研究，適合每一位想要開展“心臟類器官相關研究”的學者拜讀，文中提出了誘導分化過程中的步驟，培養基配比以及細胞類型的鑒定方法等。其描述的人類心臟類器官模型為進一步了解健康或疾病情況下心臟形成過程中心肌與心外膜的相互作用開辟了道路。但本文研究人員并未對誘導成功的類器官進行功能學鑒定，損失了一定的指導意義。
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